最佳拍档之外泌体和miR-375：合力促进骨髓间充质基质细胞的成骨分化
骨髓（BM）是神经母细胞瘤（NB）转移的主要靶器官，其与患者预后差有关，然而，NB细胞入侵BM的机制在很大程度上是未知的。肿瘤微环境是肿瘤发展的关键因素，间充质基质细胞(MSCs)被认为是相关肿瘤基质的基本组成部分。本文发现从NB的BM受累者中分离出的BM-MSCs比从非浸润性BM中分离出的MSCs具有更大的成骨潜能。本文于2020年7月发表在Journal of Extracellular Vesicles（IF:14.976）期刊上。
该文技术路线如下：
主要实验结果如下：
1、NB和BM–转移患者来源的BM-MSCs具有较强的成骨能力
提出假设：BM-MSCs在促进NB转移中发挥重要作用。然后验证假设，从12例感染NB的小孩和7例健康对照（HC）中分离得到BM-MSC细胞（Table 1）。与HC-MSCs类似，MBM-和NMBM-MSCs的CD90、CD105、CD81、CD9和GD2检测为阳性，CD34、CD45、CD56为阴性(Figure 1(a))。增殖实验显示，NMBM-、MBM-和HC-MSCs具有相似的增殖能力。为了检测成骨能力进行了组织染色和基因表达。茜素红染色显示，成骨诱导21天后，与NMBM-和HC-MSCs相比， MBM-MSCs中钙离子释放含量更高(Figure 1(c,d))，并且其成骨分化转录因子（RUNX2和OSTERIX）和成骨标志物（BMP2和SPP1）的表达也更高；而成脂分化则无显著差异(Figure 1(e,f))。这些结果表明与无BM转移患者分离的BM-MSCs相比，NB有BM浸润患者分离的BM-MSCs具有更强的成骨分化能力。
图1 MBM-MSCs具有增强的成骨潜能
2、BM转移的NB细胞系产生的外泌体增强了HC-MSCs的成骨作用
将PKH26标记的外泌体与HC-MSCs细胞共培养，合成脂质体作为阴性对照。结果显示，外泌体和脂质体都被HC-MSCs细胞内化(Figure 2(a,b)，随后增强了HC-MSCs细胞中成骨基因的表达(Figure 2(c))。为了进一步探讨外泌体对HC-MSCs细胞成骨表型的影响，观察加了不同来源外泌与HC-MSCs细胞共培养后的钙释放情况。结果显示，与IMR-32外泌体和脂质体相比，SH5YSY来源外泌体共培养的HC-MSCs细胞具有更多的钙释放含量(Figure 2(d,e))。此外，成骨标志物的表达不仅在成骨培养基中高表达在SH5YSY来源外泌体诱导组中也高表达(Figure 2(f,g))。这些结果表明BM转移性来源的NB细胞的外泌体在调节BM-MSCs的成骨分化中扮演着重要的作用。
图2 从MBM细胞中分离的外泌体可诱导HC-MSCs的成骨分化
3、MiR-375在从BM -转移来源的NB细胞系释放的外泌体和MBM-MSCs中高表达
如图3所示，对7中细胞系来源的外泌体中miRNA进行表征，结果发现外泌体miR-375的表达在PT来源的细胞系和BM来源的细胞系之间存在差异，miR-375显著高表达，在BM -转移来源的NB细胞系更是显著上调。
图3 外泌体miR-375的表达在PT来源的细胞系和BM来源的细胞系之间存在差异
随后，靶基因预测发现YAP1和DEPTOR是miR-375的靶基因(Figure 4(a))，其表达水平在NB细胞系中存在差异，与PT来源细胞系相比，在NB BM转移细胞中显著低表达，而相比于IMR32IGR-NB8，YAP1蛋白和YAP1-p几乎不在NB BM转移细胞中表达(Figure 4(b-c))。此外，经过SH5YSY来源外泌体处理过的HC-MSCs细胞中YAP1和DEPTOR的表达都显著上调了(Figure 4(f-g))。这种miR-375靶基因表达的可变性可能与样本数量少有关也可能与参与其中的分子途径有关。
图4 从SHSY5Y中分离的外泌体下调了YAP1和DEPTOR这两个miR-375的靶基因
作者首先检测了NMBM-MSCs细胞中转染miR-375后24h-96h不同时段的miR-375的表达和靶基因YAP1和DEPTOR表达。如预期的，miR-375的表达升高，YAP1和DEPTOR的表达下降，此外，成骨标志物SPP1和OSTERIX的表达也升高了(Figure 5(a-d))。与此相反的，转染miR-375 抑制剂后得到的效果与上述完全相反(Figure 5(e-g))。总之，在NMBM-MSCs中，miR-375过表达可诱导成骨基因的转录。
图5 在NMBM-MSCs中，miR-375过表达可诱导成骨基因的转录
5、MiR-375表达水平与NB患者的BM疾病相关
为了检测miR-375表达水平与NB患者的BM浸润的相关性，检测了有无BM浸润的患者中miR-375的表达，结果显示MBM患者及其外泌体中的miR-375表达均显著高于NMBM患者 (Figure 6(a-b))。为了评估miR-375在BM细胞中的表达，进行了27例NMBM患者和33例MNM患者的石蜡包埋BM样本的ISH染色。而突触素染色用于评估NB侵袭。染色强度miR-375无表达记0分，低表达1分，高表达记2分，如图Figure 6(c)。结果显示，1分和2分显著与BM浸润患者相关(Figure 6(d,e))。miR-375在MBM患者中的表达不仅存在于神经原细胞中，也存在于成骨细胞和BM的其他原生细胞中(Figure 6(f))。Figure 6(g)表明PKH26标记的SHSY5Y来源外泌体可以被BM细胞吸收，并且可以转运携带的miR-375(Figure 6(h-i))。这些结果表明循环外泌体和BM中高水平的miR-375与BM的转移有关。
图6 NB患者中MiR-375的表达与BM疾病相关
总之，本文发现在与骨NB来源的外泌体共培养后，miR-375在MBM-MSCs和HC-MSCs中的表达水平升高。基于这些结果，作者进一步发现miR-375可能通过外泌体从BM型NB细胞转移到间充质干细胞，促进成骨分化，并为转移生长创造有利的微环境(Figure6(f))。
参考文献：
Colletti Marta., Tomao Luigi., Galardi Angela., Paolini Alessandro., Di Paolo Virginia., De Stefanis Cristiano., Mascio Paolo., Nazio Francesca., Petrini Stefania., Castellano Aurora., Russo Ida., Caruso Roberta., Piga Simone., De Vito Rita., Pascucci Luisa., Peinado Hector., Masotti Andrea., Locatelli Franco., Di Giannatale Angela.(2020). Neuroblastoma-secreted exosomes carrying miR-375 promote osteogenic differentiation of bone-marrow mesenchymal stromal cells. J Extracell Vesicles, 9(1), 1774144. doi:10.1080/20013078.2020.1774144