外泌体miR92a-3p-肝癌治疗的靶点

  外泌体在肝细胞癌（HCC）的细胞间通讯和转移过程中起着重要作用。然而，不同转移潜能的异质性肝癌细胞之间的细胞通讯以及由此导致的癌症进展在HCC中尚不完全清楚。今天小编为大家介绍发表于影响因子为7.97的“Oncogene”上的文章“High-metastatic cancer cells derived exosomal miR92a-3p promotes epithelial-mesenchymal transition and metastasis of low-metastatic cancer cells by regulating PTEN/Akt pathway in hepatocellular carcinoma”，带大家了解这其中的奥秘。
  

在本文研究中，我们通过对具有不同转移潜能的肝癌细胞（MHCC-97H和97hm）进行外泌体miRNA测序，确定了miR-92a-3p为肝癌进展的潜在标志物。外源性miR-92a-3p通过靶向PTEN并调节其下游Akt/Snail信号，促进受体癌细胞上皮间充质转化（EMT）。此外，通过对不同转移潜能的肝癌细胞的mRNA测序，预测miR92a-3p的潜在转录因子，发现转录因子E2F1和c-Myc通过直接结合其宿主基因miR17HG的启动子促进细胞和外泌体miR-92a-3p的表达。最后临床资料显示，高血浆miR92a-3p水平与肝癌患者总生存率和无病生存率相关，提示HCC患者预后不良。

技术路线：

结果：

1）高转移能力肝癌细胞系（97hm和Huh7）的构建

异质性普遍存在于癌症的许多方面，包括增殖、转移和耐药性。首先，为了确定肝癌细胞的转移异质性，用迁移实验检测了5种肝癌细胞的迁移能力，确定了Huh7和SK-Hep-1肝癌细胞具有较强的迁移能力。为了确定EVs是否能将转移的优点传递给癌细胞，我们分离了Huh7和SK细胞来源的外泌体，并分别用于治疗97h和Huh7细胞。用外泌体处理的细胞，尤其是高转移癌细胞，迁移比阴性对照细胞更具侵略性（图1a，b）接着，通过对97 h和Huh7细胞持续施加选择性进化压力，从原代细胞中获得高转移性肝癌细胞（97 hm和Huhm）（图1c）。与亲代细胞相比，97hm和Huhm的迁移能力显著增强（图1d-f）。从western blot的结果来看，高转移性肝癌细胞（97hm和Huhm）的间充质相关蛋白（N-钙粘蛋白、波形蛋白、β-连环蛋白和Snail）的表达高于其亲代低转移肝癌细胞（97h和Huh7）（图1g）。

2）miR92a-3p促进肝癌的侵袭性和恶性程度
   miR92a-3p促进肝癌的体内外转移。然而，miR92a-3p在肝癌中的确切作用尚不清楚。我们发现当miR92a-3p下调时，肿瘤生长和进展在体内被显著抑制（图4a-c）。此外，上调miR92a-3p促进了97h和Huh7细胞的迁移和侵袭能力（图4d，e）。增加细胞活动性是肿瘤侵袭的基本步骤，伴随着细胞骨架的调节。在肝癌细胞中，miR92a-3p过表达组中观察到更多的微管和微丝（图4f）。然后，为了确定miR-92a-3p在肝癌演变中的作用，我们转染miR-92a-3p抑制剂降低miR-92a-3p的表达（图4k）。如图4g所示，97hm和Huhm比97h和Huh7细胞具有更高的迁移和侵袭能力，并且增强的转移能力由于97hm和Huhm细胞中miR-92a-3p的下调而降低（图4g）。接下来，我们想探讨miR92a-3p是否影响肝癌的体内转移。为了达到这个目的，我们用高转移性肝癌细胞系（97hm）构建肝转移模型。同时，经尾静脉注射抗miR92a-3p抗原。我们的结果显示miR92a-3p的下调抑制了HCC的转移（图4h-j）。

3）在高转移性肝癌的外泌体中检测到高水平的miR-92a-3p

为了确定外泌体中哪些RNA作为主要的恶性信息，我们对来自97h细胞及其进化的97hm细胞的外泌体RNA样品进行miRNA测序。结果表明，与97h外泌体相比，97hm外泌体中627个miRNA上调。图3a描绘了差异表达最多的miRNA的热图。其中，miR92a-3p是差异表达最丰富的miRNA（图3b）。此外，通过qRT-PCR，我们发现两个高转移性肝癌细胞系（97hm和Huhm）中细胞和外泌体miR92a-3p水平高于两个“正常”HCC细胞系（97h和Huh7）（图3d）。与阴性对照组相比，97h和Huh7细胞的miR92a-3p表达显著增加（图3e）。

为了确定这些miRNAs作为预后标志物的潜在作用，我们检测了这些miRNA在HCC患者血浆外泌体中的表达。HCC患者源性异种移植（PDX）小鼠模型的血浆外泌体miR92a-3p显著高于正常小鼠（图3f-h）。接下来，为了阐明miR92a-3p在转移中的潜在作用，建立了三种肝癌小鼠模型：第1组；阴性对照组，第2组；皮下HCC异种移植（无肺转移）和第3组；原位HCC异种移植（有肺转移）（图3i，j）。与第1组相比，皮下肝癌小鼠血浆中的外泌体miR92a-3p略有增加，而转移瘤小鼠（第3组）血浆中miR92a-3p显著增加（图3k）。这些结果表明，在体外和体内，miR92-3p的表达随着肝癌的发展而增加，因此，miR92a-3p可能是肝癌进展的有效标志。

4）miR92a-3p促进肝癌的侵袭性和恶性程度

miR92a-3p促进肝癌的体内外转移。然而，miR92a-3p在肝癌中的确切作用尚不清楚。我们发现当miR92a-3p下调时，肿瘤生长和进展在体内被显著抑制（图4a-c）。此外，上调miR92a-3p促进了97h和Huh7细胞的迁移和侵袭能力（图4d，e）。增加细胞活动性是肿瘤侵袭的基本步骤，伴随着细胞骨架的调节。在肝癌细胞中，miR92a-3p过表达组中观察到更多的微管和微丝（图4f）。然后，为了确定miR-92a-3p在肝癌演变中的作用，我们转染miR-92a-3p抑制剂降低miR-92a-3p的表达（图4k）。如图4g所示，97hm和Huhm比97h和Huh7细胞具有更高的迁移和侵袭能力，并且增强的转移能力由于97hm和Huhm细胞中miR-92a-3p的下调而降低（图4g）。接下来，我们想探讨miR92a-3p是否影响肝癌的体内转移。为了达到这个目的，我们用高转移性肝癌细胞系（97hm）构建肝转移模型。同时，经尾静脉注射抗miR92a-3p抗原。我们的结果显示miR92a-3p的下调抑制了HCC的转移（图4h-j）。

5）miR92a-3p通过靶向PTEN调节Akt/Snail途径促进EMT

肿瘤转移的发生与癌细胞内的EMT密切相关。我们想探讨miR92a-3p是否参与了肝癌EMT的调控。正如预期的那样，miR92a-3p的过表达增加了间充质生物标记物（N-cadherin、β-catenin、Snail）的表达，同时降低了E-cadherin的蛋白质水平（图5a，b）。为了确定miR92a-3p的靶点，利用miRDB、miRWalk、TargetScan和miRTarBase四个数据库对miR92a-3p的潜在靶点进行预测，并用qRT-PCR进行验证，PTEN下降最明显（图5c）。western blot检测发现PTEN蛋白的表达在miR92a-3p过表达后显著降低。因此，可以推断miR-92-3p下调了肝癌中PTEN的表达。然后，我们构建了含有3’-UTRd的PTEN mRNA的双荧光素酶报告质粒系统（图5d）。结果显示miR92a-3p直接与PTEN 3’UTR相互作用，降低PTEN的表达（图5d）。通过Western blot，我们发现miR92a-3p抑制PTEN的表达，然后上调磷酸化Akt、磷酸化mTOR和磷酸化GSK-3β（图5e）。最后，我们发现AntigomiR-92a-3p减少了由外泌体引起的肝癌转移（图5f）。

6）miR92a-3p抑制和PTEN过表达可中和高转移性HCC源性外泌体介导的EMT

我们发现一旦PTEN被质粒过表达（图6a），miR92a-3p过表达引起的HCC中增强的迁移和侵袭能力会恢复到正常水平（图6b）。western blot结果显示，体外转染PTEN高表达质粒后，PTEN和Ecadherin的下调和磷酸化Akt和Snail的上调恢复到基础水平（图6c）。其次，为了阐明miR-92a3p在体内是否影响PTEN/Akt通路，采用皮下肿瘤异种移植模型。结果表明97hm外泌体治疗促进肿瘤生长，这种促进作用被AntigomiR-92a-3p的治疗中和（图6d，e）。免疫组化结果显示在高转移性肝癌源性外泌体治疗后，PTEN表达降低，磷酸化Akt和Snail蛋白水平上调。然而，一旦肿瘤移植物中的miR92a-3p被antigomiR92a-3p中和，PTEN、p-Akt和Snail水平则在体内恢复到基础水平（图6f）。提示miR92a-3p通过调节PTEN/Akt通路促进EMT，在HCC的转移中起重要作用。

7）转录因子E2F1和c-Myc促进miR-92a-3p的表达

为了确定可能导致miR92a-3p上调的TFs，在97h细胞和97hm细胞之间进行mRNA测序（图7a）。结合mRNA测序结果与JASPAR数据库，发现37个候选基因可能直接促进miR92a-3p的表达（图7b）。经GSEA分析后，发现与97h细胞相比，在97hm细胞中E2F1和c-Myc相关的途径显著富集（图7c）。此外，与97H和Huh7相比，97H和Huhm中这两种TFs的mRNA和蛋白质表达也增加（图7d，e）。E2F1和c-Myc的过表达促进了肝癌细胞中miR17-92簇中miR92a-3p和其他成员的表达（图7f，g）。为了验证miR-92a-3p的宿主基因miR17HG启动子中c-Myc结合位点（cbs）和E2F1结合位点（EBSs），我们进行了染色质免疫沉淀（ChIP）分析。如图7h所示，有三个cbs和两个ebs；CBS1和EBS1通过Southern blot试验进一步证实（图7i）。然后，我们构建miR92启动子荧光素酶报告质粒系统，并与E2F1和c-Myc高表达质粒共转染97h细胞。转染后检测荧光素酶活性。如图7j所示，E2F1和c-Myc都能激活miR92a-3p的表达，说明E2F1和c-Myc直接结合miR17HG的特异性DNA序列，促进miR92a-3p在肝癌细胞中的表达。

8）miR-92a-3p水平与HCC肺转移和肿瘤进展相关

为探讨miR92a-3p在HCC患者中的作用，采用原位杂交技术检测miR92a3p在肝癌组织及癌周组织中的表达。如图8a所示，与癌周组织相比，在肝癌组织中miR92a-3p升高，这与来自GEPIA数据库的数据一致（图8b）。更重要的是，与无血管侵犯的肝癌组织相比，有血管侵犯的肝癌组织中miR-92a-3p水平更高（图8a）。其次，我们检测了42例HCC患者（21例无转移，21例有转移）血浆中miR-92a-3p的表达。有转移的肝癌患者血浆中miR-92a-3p的水平显著高于无转移的HCC患者（图8c）。为了进一步了解miR92a-3p表达与疾病进展之间的关系，我们收集了原发性肝癌患者术前和术后血浆样本，并用其检测外泌体miR92a-3p的表达。如图8d所示，通过手术切除肿瘤后，外泌体miR92a-3p水平降低。根据血浆miR92a-3p的水平将肝癌患者分为两组（miR92a-3p高表达组和miR92a-3p低表达组），miR92a-3p高表达与总生存率低、无病生存率差相关，提示HCC患者预后差（图8e）。此外，无转移的肝癌患者与有转移的肝癌患者相比，外泌体miR92a-3p的AUCROC为0.8534（图8f）。综上所述，miR-92a-3p在高转移能力的肝癌细胞和有转移的肝癌患者中过表达。HCC来源的外泌体miR-92a-3p通过介导PTEN的降低和激活Akt/Snail信号通路来促进EMT和HCC的转移，将“正常”的HCC细胞转化为更具侵袭性的HCC细胞（图8g）。

    结论：肝源外泌体miR92a-3p通过抑制PTEN和激活Akt/Snail信号通路，在EMT进展和促进转移过程中发挥关键作用。外泌体miR92a-3p是一种潜在的预测HCC转移的生物标志物。这一认识可能会促进针对肝癌转移的新的治疗和预防策略的发展。