circRNA猎杀癌细胞的新招式
肾细胞癌（RCC）是世界上最致命的恶性肿瘤之一，2020年预计美国有七万新增病例及一万四千的死亡病例。circRNA已在多种人类癌症中表现出关键作用，然而其在RCC中的作用仍保有较大程度的未知性。本文发现circPTCH1通过调控miR-485-5p/MMP14轴促进RCC的侵袭和迁移，于2020年10月发表于《Theranostics》IF:8.579。
技术路线如下：
主要结果如下：
1、RCC细胞中circPTCH1的芯片分析与鉴定
作者通过对5种转移性RCC细胞系和配对的正常切片的芯片分析，鉴定差异表达的circRNA，作者挑选的是最显著的5个进行qRT-PCR分析，最终确认只有hsa_circ_0139402在RCC细胞系中显著上调（Figure 1A-B）。其结构组成是来源于宿主基因PTCH1外显子13和14背向剪切形成，将其命名为circPTCH1。circPTCH1不能被RNase R酶消化，定位于细胞质。
图1 circPTCH1在RCC细胞中的表达及特征分析
2、circPTCH1增强RCC的迁移和侵袭
如图2所示，敲除circPTCH1后RCC细胞系的迁移和侵袭减弱，相反，过表达circPTCH1后RCCC细胞系的迁移和侵袭增强。
图2 circPTCH1在体外可增强RCC细胞的迁移和侵袭能力
3、在RCC细胞中circPTCH1作为miR-485-5p的海绵
众所周知，定位于细胞质的circRNA通常是作为miRNA的海绵发挥作用，因此本文通过三个数据库共同鉴定到9个潜在的靶向miRNA（Figure 3A-B）。生物素探针实验发现只有miR-485-5p, miR-545-3p, 和miR-330-5p可以被显著下拉富集（Figure 3C-E）。进一步的，只有miR-485-5p在肿瘤中显著下调，并经实验证实与circPTCH1存在相互结合作用。这些结果表明，在RCC细胞中circPTCH1作为miR-485-5p的海绵发挥作用。
图3 circPTCH1作为miR-485-5p的海绵
4、miR-485-5p通过靶向MMP14抑制RCC细胞的迁移和侵袭
如图4A-D所示，抑制或过表达miR-485-5p会增强或减弱RCC细胞的迁移和侵袭。随后，通过4个数据库共同确定了39个潜在的靶基因，其中MP14的表达最为丰富。实验发现MMP14的表达水平在肿瘤组织中显著上调，与miR-485-5p的表达负相关，且两者具有相互结合作用。抑制或过表达miR-485-5p会增强或减弱RCC细胞中MMP14的蛋白表达水平。这些结果表明miR-485-5p通过靶向MMP14抑制RCC细胞的迁移和侵袭。
图4 miR-485-5p在体外通过靶向MMP14抑制细胞迁移和侵袭
5、circPTCH1通过miR-485-5p/MMP14促进RCC细胞的迁移，侵袭，和EMT
作者随后通过挽救实验进一步发现，circPTCH1的干扰降低了RCC细胞的迁移能力，然而，与miR-485-5p抑制剂共转染可以部分消除这种效应。此外，敲除circPTCH1降低了MMP14的水平，但共转染miR-485-5p抑制剂可以恢复期表达。类似的现象也在N-candherin和Vimentin中观察到，而E-candherin表达趋势则完全相反。这些结果表明circPTCH1通过miR-485-5p/MMP14促进RCC细胞迁移，侵袭，和EMT表型。
图5 circPTCH1通过miR-485-5p/MMP14轴促进RCC细胞的迁移、侵袭和EMT
与体外实验结果一致，如图6所示，过表达circPTCH1小鼠体内的肿瘤转移结节显著增多，而抑制miR-485-5p则能部分缓解这种效应，表明circPTCH1在体内通过miR-485-5p/MMP14轴促进肿瘤转移和RCC进展。
图6 circPTCH1在体内促进肿瘤转移
总之，本文发现PTCH1基因13和14号外显子反向剪切形成的circPTCH1在细胞质中海绵吸附miR-485-5p，而miR-485-5p可以靶向调节MMP14的表达，进而促进EMT表型，最终导致RCC的进展和转移（图7）。
图7 原理图显示circPTCH1通过miR-485-5p/MMP14轴促进RCC转移