CircRNA与胶质母细胞瘤耐药研究新进展

   导语：获得性化疗耐药是胶质母细胞瘤(GBM)临床治疗的一大挑战。环状RNA已被证实在肿瘤化疗耐药中起作用。然而，其潜在机制仍不清楚。今天小编给大家分享一篇关于CircRNA与胶质母细胞瘤耐药的研究，探一探关于肿瘤耐药别的研究思路。

技术路线

结果：

1. CircASAP1在TMZ治疗后TMZ耐药的GBM细胞和组织中高表达

   收集3对术后和替莫唑胺治疗后的原发性（Pri GBM）和复发性（Rec GBM）胶质母细胞瘤组织样本，测序鉴定出在Rec GBM 中上调最多的circASAP1，CircASAP1在两种TMZ耐药细胞系N3T3rd和U251T3rd中的表达显著高于TMZ敏感细胞系（N3s和U251s）。Kaplan-Meier分析确定circASAP1低表达的患者在TMZ治疗后比circASAP1高表达的患者表现出更好的OS。Sanger测序、PCR和琼脂糖凝胶电泳检测、转录抑制剂放线菌素D处理及RNase R处理鉴定CircASAP1的环状结构。这些表明在TMZ耐药的GBM细胞系和组织中circASAP1表达上调，指出circASAP1与获得性TMZ耐药之间可能存在关系。

2. CircASAP1在体外促进增殖和TMZ耐药
   探索circASAP1在GBM肿瘤发生和获得性TMZ耐药中的作用。耐药细胞敲除circASAP1可显著抑制细胞增殖，下调circASAP1可明显增强细胞凋亡的水平，激活caspase-3及其底物PARP的裂解。当过表达circASAP1时，TMZ诱导的细胞增殖被促进、细胞凋亡减少。这些结果表明敲低circASAP1可抑制TMZ耐药细胞的增殖，恢复TMZ敏感性。

3. RNA结合蛋白EIF4A3调控circASAP1的表达

   为探索circASAP1在GBM中是如何差异表达的，CircInteractome预测与circASAP1侧翼区匹配的RNA结合蛋白位点，其中EIF4A3的结合位点最多。RNA pull-down实验验证EIF4A3与circASAP1的下游侧翼序列结合。EIF4A3的下调导致circASAP1表达减少，而过表达EIF4A3可增加circASAP1表达。此外，在15个临床样本中circASAP1和EIF4A3之间存在正相关性。沉默circASAP1并没有改变EIF4A3 mRNA或蛋白水平。总之，EIF4A3通过与侧翼序列结合增加circASAP1的表达。

4. CircASAP1作为miR-502-5p的海绵
   研究了circASAP1潜在的功能机制。核质分离检测和FISH分析CircASAP1主要分布于细胞质。CircASAP1可以直接与RNA诱导沉默复合体(RISC)的核心组分Argonaute-2(Ago2)结合，荧光素酶报告基因结果进一步证实circASAP1可能作为Ago2和miRNA的结合平台。CircInteractome数据库预测21个候选miRNA，5个miRNA（miR-136、miR-566、miR-1205、miR-145和miR-502-5p）能够降低荧光素酶报告活性至少30%。为确定哪些miRNA在肿瘤抑制中起作用，将单个miRNA模拟物转染到TMZ耐药细胞中，发现miR-502-5p可显著抑制细胞生长；特异性生物素化的miR-502-5p探针成功捕获circASAP1；miR-502-5p介导的荧光素酶活性抑制被预测结合位点内circASAP1的突变恢复，证实了circASAP1和miR-502-5p之间的直接相互作用。

   circASAP1缺失的耐药细胞中敲低或过表达miR-502-5p，miR-502-5p过表达明显抑制细胞生长，而敲低miR-502-5p促进细胞增殖，miR-502-5p恢复了circASAP1缺失的耐药细胞的TMZ耐药性，而miR-502-5p抑制剂逆转了这一效应。同样，miR-502-5p过表达明显增加caspase-3的凋亡比率和活化。综上所述，circASAP1作为miR-502-5p的分子海绵，两者都参与GBM获得性TMZ耐药的分子机制。

5. NRAS是miR-502-5p的内源性靶点
   数据库与KEGG通路分析预测miR-502-5p的8个靶标，上调miR-502-5p可降低NRAS表达，而anti-miR-502-5p则表现出相反作用。TMZ耐药细胞NRAS表达高于TMZ敏感细胞，CircASAP1与NRAS表达呈正相关。miR-502-5p直接结合到NRAS 3’-UTR区域，miR-502-5p抑制剂和模拟物分别使NRAS蛋白水平升高和降低。RIP检测发现NRAS可与Ago2结合。在tmz耐药细胞中，CircASAP1敲低导致招募到NRAS转录本的Ago2显著增加。TMZ敏感细胞中circASAP1过表达导致Ago2的富集增加，但与NRAS转录本结合的Ago2的富集减少。敲低circASAP1表达显著降低NRAS mRNA和蛋白水平。

   circASAP1敲低后NRAS报告基因的荧光素酶活性下降，被miR-502-5p抑制剂挽救。在circASAP1过表达时，NRAS WT报告基因的荧光素酶活性升高，miR-502-5p模拟物消除这种效应。NRAS的RNA和蛋白水平受circASAP1和miR-502-5p的调控。这些数据证明circASAP1作为miR-502-5p的分子海绵促进NRAS的表达。

6. CircASAP1通过NRAS/MEK1/ERK1/2信号促进肿瘤生长和TMZ耐药

   NRAS参与多个信号通路的调节，敲低NRAS表达可降低TMZ耐药细胞的克隆形成，过表达NRAS可恢复circASAP1缺失的TMZ耐药细胞对TMZ的耐药性。sh-circASAP1抑制NRAS/MEK1/ERK1/2信号的激活，但过表达circASAP1激活这种信号。这些结果证明NRAS在circASAP1介导的TMZ耐药中对细胞生长和凋亡抑制发挥调节作用，circASAP1通过NRAS/MEK1/ERK1/2途径调节细胞凋亡。

   研究circASAP1在体内对耐药表型的影响。荧光素酶标记的sh-circASAP1-或sh-ctrl转导的N3T3rd细胞注射到裸鼠体内，发现circASAP1缺失的N3T3rd细胞组成的异种移植物表现出显著的肿瘤消退。用TMZ处理荷瘤小鼠，发现CircASAP1耗竭有效地恢复TMZ耐药异种移植物对TMZ治疗的敏感性，接受这种联合治疗的小鼠寿命延长。敲低circASAP1后Ki-67和NRAS的表达下降。

总结：
1. 鉴定在复发性胶质母细胞瘤组织样本和TMZ耐药细胞系中异常表达的circRNA——circASAP1。

2. CircASAP1通过NRAS/MEK1/ERK1/2信号促进肿瘤生长和TMZ耐药。

参考文献：

EIF4A3-induced circular RNA ASAP1(circASAP1) promotes tumorigenesis and temozolomide resistance of glioblastoma via NRAS/MEK1/ERK1/2 signaling （NEURO-ONCOLOGY，IF=10.247）

Yutian Wei#, Chenfei Lu#, Peng Zhou#, Lin Zhao#, Xiao Lyu, Jianxing Yin, ZhuMei Shi and Yong ping You