LncRNA与转录因子的研究思路

   导语：FOXA1是一组被称为先驱因子的特殊转录因子(TF)的成员，启动转录网络，在乳腺癌、前列腺癌和肺癌的肿瘤发生发展中至关重要。以往关于FOXA1的研究主要集中在蛋白编码基因上，长链非编码RNA（lncRNA）是否参与FOXA1调控网络？各位看官，细听小编慢慢来说。

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技术路线

结果

1. DSCAM-AS1是一种由FOXA1调控的谱系特异性致癌lncRNA

   为揭示FOXA1调控网络的致癌作用，分析具有致癌功能的FOXA1应答lncRNA。TCGA泛癌症数据和癌细胞系百科全书数据发现FOXA1在前列腺腺癌(PRAD)、乳腺癌(BRCA)和肺腺癌(LUAD) 中 表达升高。接下来分析PRAD、BRCA和LUAD中异常表达的lncRNA，分析Nacht等人报道的公共si-FOXA1 RNA-seq数据，鉴定出5个重叠的lncRNA。ChIP-seq数据分析启动子区域潜在的FOXA1结合位点，发现DSCAM-AS1(ENSG00000235123)在TSS(±10kb)周围的潜在结合位点数量最多。因此，选择DSCAM-AS1进行进一步研究。TCGA数据和CLE数据显示DSCAM-AS1在乳腺癌、肺癌和前列腺癌中特异性表达，在癌旁正常组织中不表达。

2. DSCAM-AS1由FOXA1驱动的超级增强子直接调控

   癌症中基因的异常表达通常是由拷贝数变异(CNVs)、表观遗传和转录失调引起的，首先分析DSCAM-AS1基因体的CNVs状态。超级增强子常参与控制谱系特异性表达和细胞鉴别。H3K27ac被公认为是活性增强子和超级增强子的标记。DSCAM-AS1是位于DSCAM基因大内含子（约320kb）中的反义lncRNA。DSCAM-AS1具有两个超级增强子信号，H3k27ac ChIP-seq数据显示两个超级增强子簇存在于ER + 中，但在ER-乳腺癌细胞系中缺失。发现一个超级增强子(SE1)覆盖DSCAM-AS1的整个基因体，包括启动子区。另一个超级增强子簇(SE2)在DSCAM-AS1上游约60kb。

   T47D细胞系的Hi-C数据分析SE2与SE1以及DSCAM-AS1 TSS之间的相互作用。低浓度下，超级增强子相关基因对转录抑制剂（如BRD4抑制剂JQ1）高度敏感，极低浓度的JQ1导致DSCAM-AS1显著减少。ChIP-qPCR检测显示DSCAM-AS1上游和基因体区域H3K27ac均显著富集。综上所述，这些数据揭示DSCAM-AS1受到超级增强子的转录调控。FOXA1是TF的先驱，并作为雌激素受体转录功能的关键决定因素。ChIP-seq鉴定FOXA1与DSCAM-AS1绑定。在肺腺癌、乳腺癌和前列腺癌细胞系中敲低FOXA1后SCAM-AS1水平显著降低。这些揭示FOXA1可直接与DSCAM-AS1的启动子结合，并调节其在肺腺癌、乳腺癌和前列腺癌细胞中的表达。综上所述，DSCAM-AS1是FOXA1的直接靶点。

3. DSCAM-AS1通过调控FOXA1和ERα的表达发挥致癌作用

    研究DSCAM-AS1在乳腺癌和肺腺癌细胞中的生物学作用。沉默DSCAMAS1可显著降低乳腺癌细胞系的增殖、落生长、细胞中G1-S转换。敲除DSCAM-AS1后，在乳腺癌和肺腺癌细胞中观察到显著的生长抑制。

   DSCAM-AS1可调节FOXA1和ERα超级增强子相关转录因子的表达，它们相互形成正反馈回路，被称为核心转录调节回路(CRC)。为探索超级增强子相关lncRNA是否也能调控TF的表达并参与形成CRC，测量敲除DSCAM-AS1后乳腺癌和肺腺癌细胞系中FOXA1的表达。默DSCAM-AS1后FOXA1的mRNA和蛋白水平显著降低，表明DSCAM-AS1可能在转录水平调节FOXA1的表达。ERα是ER + 乳腺癌中与FOXA1共结合的主要调节因子。沉默或敲除DSCAM-AS1后，ERα在mRNA和蛋白水平的表达均显著降低。这些表明DSCAMAS1调节FOXA1和ERα的表达。

4. DSCAM-AS1与YBX1相互作用

   探索DSCAM-AS1对FOXA1和ERα调节的分子机制。RNA pull-down实验显示在约50 KD处强条带，质谱分析该条带。SURF-6和YBX1是质谱获得的顶级候选物之一，沉默了SURF-6未减少细胞增殖。YBX1是一种DNA结合和RNA结合蛋白，转录和转录后水平调节基因表达。蛋白质印迹法、RIP-qPCR实验进一步验证这种相互作用。敲低YBX1的MCF7细胞的增殖被抑制。这些揭示DSCAM-AS1的功能依赖于与YBX1的相互作用。

5. DSCAM-AS1的缺失损害YBX1在FOXA1和ERα启动子区域的募集
   除作为RNA结合蛋白，YBX1还作为转录因子发挥作用。分析YBX1的ChIP-seq数据，观察到FOXA1和ERα的启动子区域有明显的峰值，ChIP-qPCR检测进一步验证这些结合位点。此外，敲除YBX1导致FOXA1和ERα在mRNA和蛋白水平均受到显著抑制，这揭示了YBX1可转录激活FOXA1和ERα。沉默DSCAM-AS1后，YBX1的募集显著减少。这些表明DSCAM-AS1的缺失损害了YBX1在启动子区域的结合，减少了FOXA1和ERα的转录激活。

6. DSCAM-AS1的临床相关性和体内功能研究

   为探索DSCAM-AS1表达的临床相关性，Kaplan-Meier分析发现DSCAM-AS1的高表达与ER + 乳腺癌患者的低生存期显著相关。在肺腺癌中观察到相似结果。分析DSCAM-AS1相互作用蛋白YBX1的临床相关性，发现YBX1的高表达与不良预后相关。为研究DSCAM-AS1在体内的作用，使用MCF7 DSCAM-AS1 KO细胞进行异种移植试验。证明DSCAM-AS1缺失影响MCF7异种移植肿瘤的生长，DSCAM-AS1敲除细胞的肿瘤形成率显著降低。

总结：

1. DSCAM-AS1被FOXA1驱动的超级增强子转录激活，并表现出谱系特异性表达模式；

   2. DSCAM-AS1的缺失抑制细胞生长，并减少FOXA1和ERα的表达；

3. 机制上，DSCAM-AS1与YBX1相互作用，增强YBX1在FOXA1和ERα启动子区域的募集。