eRNAs是肺癌发生的新调控因子

肺癌是全球范围内与癌症相关的死亡率的主要原因。腺癌是肺癌的主要组织学亚型，占肺癌病例大约40％。尽管最近多模式疗法方面取得了进展，但肺腺癌的总体5年生存率仍约为15％。这主要是由于晚期诊断和缺乏有效的治疗靶点。肺腺癌的发展是一个多步骤的，不断发展过程，其中涉及环境暴露和分子改变，包括种系变异，体细胞变异，转录和外遗传改变的多样性之间的相互作用。

最近，通过整合多维组学数据，癌症基因组图谱（TCGA）小组对肺腺癌进行了分析，并确定了几种致癌途径中具有可靶向候选物的分子亚型。但是，由于肿瘤内异质性，肺腺癌发生和发展的生物学机制仍然难以捉摸。尽管一些肺腺癌相关增强子RNA（eRNAs）已经TCGA样本中描述了，但它们的转录表观、分子特征以及中国肺腺癌中的临床应用在很大程度上仍然未知。

近日，南京医科大学公共卫生学院全球卫生中心流行病学教研室的马红霞教授及其团队通过整合来自南京肺癌队列（NJLCC）的80例肺腺癌患者的全基因组测序（WGS）和RNA-seq，提出肺腺癌中eRNA的全基因组检测和表征，并在481例TCGA肺腺癌患者中进一步评估了基于eRNA的分子亚型的分子特征和预后价值。相关研究以“Comprehensive characterization of functional eRNAs in lung adenocarcinoma reveals novel regulators and a prognosis-related molecular subtype”为题发表在Theranostics杂志上，杂志影响因子为8.579。

技术路线：

结果：

1、  肺腺癌中的eRNA

作者用80个NJLCC肺腺癌肿瘤旁正常对的RNA-seq数据，全面分析了48453个先前注释的增强子（FANTOM5和ENCODE）的表达信号（图A），共检测到11937个eRNAs，在超过10%的样本中有表达，包括1552个外显子，3297个基因间和7088个内含子eRNAs（图B）。此外，将3297个中位长度为699 bp(75 ~ 6598 bp)的基因间eRNA纳入以下分析，以避免转录基因的影响。肿瘤样本在整体水平（所有eRNA的表达组合）（图C）和个体水平（每个eRNA的表达）的eRNA表达均显著高于癌旁正常样本，其中15.68%的eRNA在肿瘤样本中高表达，7.19%在癌旁样本中高表达（图D）。

2、  吸烟暴露影响eRNA表达的表观遗传调控

当评估按年龄、性别或吸烟史划分的亚组间eRNA的表达差异时，发现eRNA表达与年龄或性别无相关性（图A）。然而，吸烟者的正常组织中eRNA表达比不吸烟者显著升高，正常吸烟者的表达水平与肿瘤样本中的表达水平相当（图B）。这些发现表明，吸烟暴露和肿瘤发生的过程都会影响eRNAs的表观遗传修饰。共表达和GSEA分析阐明了4组样本（吸烟者和非吸烟者的肿瘤样本以及正常癌旁样本）中3297个eRNAs的生物学功能（图C）。在肿瘤（吸烟者和非吸烟者）样本中发现的eRNA相关基因主要参与免疫系统相关通路，即适应性免疫应答通路，在肿瘤非吸烟者中鉴定出的eRNA相关基因也参与细胞周期相关通路，即染色体分离通路。在正常（吸烟者和非吸烟者）样本中鉴定出的基因主要参与修饰和mRNA代谢过程相关途径。当使用Reactome和KEGG数据集时，在不吸烟者的肿瘤样本中复制细胞周期和免疫系统相关通路中eRNA相关基因的特异性富集（图D-E）。

3、  癌症驱动基因和临床可操作基因在eRNA相关基因中过度表达

为了确定肺肿瘤发生过程中的eRNAs相关基因，我们在肿瘤样本中建立了一个整体的eRNA-基因调控网络，并确定了14267个与3204个eRNAs有显著表达相关性的PCGs，其中9239个位于2471个共表达eRNAs的同一染色体。eRNAs和相关基因之间的距离直方图随着距离的增加而急剧衰减，并在一个Mbp距离内表现出显著的富集（图A）。52.56% PCGs被定位到少于3个不同的eRNAs（图B），而55.00%的eRNAs被预测与少于10个相关PCGs相互作用（图C）。然后，从癌症基因普查（CGC）中收集了615个候选癌症驱动基因和135个癌症临床可操作基因（CAGs），并确定81.46%的CGC基因和82.96%的CAGs与eRNA相关。这两组癌症相关基因在eRNA相关基因中明显过度表达，应用GSEA方法时也观察到相似的结果（图D-E）。

4、  基于eRNAs的功能性聚类与基因组畸变相关

基于共表达的eRNA-PCG对，作者将188个（129个上调，59个下调）共表达上调或下调PCGs的eRNAs定义为进行一系列过滤过程后肺腺癌的功能性eRNA-PCG对，基于这188个eRNA的共有聚类分析得到了3个稳健的簇（簇1、簇2和簇3）（图A），尽管三个簇中的患者具有相似的表达水平，但两种最常见的癌症基因组事件类型（体细胞突变和拷贝数改变）差异很大（图B）。簇1中的患者表现出正常样基因组模式，基因组改变水平最低；然而，SETD2（一种已确定的肺腺癌突变驱动基因）仅在这些患者中发生突变；集群2中的患者富集了吸烟者和具有中位突变率水平和拷贝数改变水平；由于簇3中的患者具有最高水平的基因组改变，许多基因的拷贝数改变被过度表达，如TERC、PTPRD和MYC。由于簇3中的患者表现出最高的基因组不稳定性水平，我们确定与其他两组患者相比，该组患者中下调的基因主要参与来自NJLCC和TCGA项目的免疫相关通路（图 C）。然后，作者评估了簇3中患者的临床结局，并确定与簇1中的患者相比，该组患者的生存状态相对较差，以OS和PFI作为终点，而DFI不是终点（图D）。

5、  拷贝数扩增激活肺腺癌中eRNA的表达

当评估基因组改变对eRNA表达的影响时，我们观察到与扩增基因组部分呈正相关（图A），其中未发现体细胞突变率的显著相关性（图B）。通过整合拷贝数信息（图C），我们确定了上述129个上调的eRNAs中的4个在肺腺癌样本中被CNA激活，这些eRNAs靶向FOXO6、TERT和PAX9。一个有趣的发现是FOXO6作为肺腺癌的一个新的驱动基因的鉴定，观察到两个NJLCC中EGFR突变样本中FOXO6-eRNA和FOXO6的表达显著升高，表明FOXO6-eRNA的激活可能是EGFR依赖性的。

结论：

本研究鉴定的eRNA相关基因主要参与细胞周期和免疫系统相关途径，基于eRNA的共识聚类进一步确定了一种具有免疫缺陷和高水平基因组改变的新型分子亚型，其与肺腺癌患者的不良临床结局相关。eRNAs的全基因组鉴定和表征揭示了肺癌发生的新调控因子，这为理解肺癌发生过程中的eRNAs提供了一个新的生物学维度，并强调了基于eRNAs的分子亚型在肺腺癌治疗中的临床实用性。

参考文献：

Na Qin1, Zijian Ma, Cheng Wang, et al. Comprehensive characterization of functional eRNAs in lung adenocarcinoma reveals novel regulators and a prognosis-related molecular subtype. Theranostics. 2020; 10(24): 11264-11277.