人类胎儿生长受限的核心调控模块和基因特征

胎儿生长受限（FGR）是造成围产期死亡和发病的主要原因，影响胎儿长期健康。为了确定妊娠期核心基因表达网络和基因特征，结合超声确认可以更有效地区分胎龄和病理性FGR群体的正常体质，作者对脐带血进行了全转录组测序。本文于2020年9月发表于《Clinical and translational medicine》期刊上。

技术路线如下：

主要研究结果如下：

1、FGR和对照脐带血的转录组明显不同

对正常组和FGR组的脐带血进行全转录组测序，如图1， 作者分析了两种情况下的蛋白编码基因、lncRNAs和miRNAs的差异表达情况，其中蛋白编码基因在FGR组倾向于下调表达，而lncRNAs和miRNAs则倾向于上调表达。作者还列举了FGR家族的代表性表达情况（图1d和e）。

图1 FGR和对照脐带血的转录组明显不同

 2、差异表达的蛋白质编码基因和生理功能信号通路

总计鉴定到339个差异表达的蛋白质编码基因，与对照相比，在FGR组上调的有224个，下调的是115个。图2b-c是下调的基因富集到的GO条目和KEGG通路；图2d-e是下调的基因富集到的GO条目和KEGG通路。随后作者使用GSEA分析了这些差异表达基因涉及的信号通路，如图2f-i。

图2差异表达的蛋白质编码基因和生理功能信号通路

 3、差异表达的miRNA和生理功能信号通路

基于具有较大log2（倍数变化）的前30个高度变化的miRNA，包括13个显著差异表达的miRNAs，预测它们的靶基因，并展示出最常见的前30个靶基因（图3b）。随后分析了这些靶基因的GO和KEGG分析的结果（图3c-d）。利用人类MicroRNA疾病数据库(HMDD, v2.0)对预测靶点和人类疾病的综合分析表明，这些miRNA与免疫细胞和已发表的疾病显著相关（图3e）。此外，这些miRNA优先聚类于miR-194家族和Chr14_100911139-100911213 cluster（图3f-g）。上述结果表明这些差异表达的miRNAs不仅与FGR相关的疾病有关，而且还集中于特定的基因簇和各种疾病。

图3差异表达的miRNA和生理功能信号通路

 4、FGR的核心调控网络和印迹基因

测序中总计鉴定到79个显著下调和216个显著上调的lncRNAs（图4a）。研究发现在339个编码基因和295个lncRNAs间显示出7个lncRNAs在一个2kb的区域顺式调节其邻近的蛋白质编码基因（图4b），此外也获得了7616个反式调节的lncRNAs。为了清楚地展示反式调控关系，作者将差异表达程度较大的前35个lncRNA和蛋白编码基因显示出来(图4c)。结合lncRNA-mRNA，miRNA-mRNA和miRNA-lncRNA分析，在用Pearson相关系数（PCC）（绝对值> 0.9）筛选后，观察到7个顺式，59个反式和2个miRNA调控关系（图4d）。具有顺式调控关系的lncRNA和蛋白质编码基因的PCC为正，而具有lncRNA及其反式调控的蛋白质编码基因的PCC为负（图4e）。

由于印迹基因在生长发育中非常重要，所以作者基于240个印迹基因进行了进一步分析（图4f），这些印迹基因与FGR呈显著负相关，其中有6个印迹基因在FGR组和对照组间差异表达，如Col9a3，Dlk1，Fuca1，Lilrb4，Sfrp2和Ventx（图4i）。这些结果观察到一簇印迹基因与FGR相关可能为FGR提供了潜在的标志物。

图4 FGR的核心调控网络和印迹基因

 5、关键基因共表达网络模块与FGR密切相关

为了阐述FGR中重要的基因共表达网络，作者进行了WGCNA并将FGR和对照组进行了全转录组聚类（图5a）。所有的这些基因聚为18个模块，大部分基因聚类在绿松石色模块，富集于中性粒细胞脱颗粒（图5b）。皮尔逊相关系数分析了网络模块和样品性状间的关系，结果显示绿松石和紫色模块与出生重量显著正相关，而绿松石和午夜蓝模块在FGR组和对照组间显著差异（图5c）。模块的稳定性分析表明前四个模块，包括绿松石，蓝色，棕色，和黄色模块都展示出较高的稳定性（图5d）。层次聚类分析表明绿松石模块与出生重量显著相关并且可以明显区分FGR组和对照组（图5e）。GO富集和通路分析表明绿松石模块主要富集于肿瘤中破骨细胞分化和癌症中转录失调（图5f）。这些结果表明关键模块绿松石与FGR显著相关，但是模块中的基因的进一步大样本验证研究将有助于为FGR提供更多的证据。

图5 关键基因共表达网络模块与FGR密切相关

 6、蛋白质编码基因、lncRNA和miRNAs作为FGR的潜在标记

作者对转录组中的差异表达基因进行了qRT-PCR验证包括两个印迹基因（Sfrp2 and Dlk1），一个蛋白编码基因Slpi，5个lncRNAs（图6a）。ROC曲线显示，RP11_552M6.1、LINC01291、Asgr1的曲线下面积(AUC)值可达到0.958，表明具有显著预测FGR的潜力（图6b）。为了观察其在临床应用的潜力，检测了12对FGR病例和对照产妇外周血标本中差异表达分子的表达水平。ROC曲线表明Sfrp2、miR-432-5p、miR- 1306-3p在FGR产妇外周血中的表达模式具有显著的预测能力(AUC = 0.882)（图6c）。这些结果表明这些蛋白编码基因，lncRNAs，miRNAs都与FGR密切相关，并且可能为FGR提供潜在的标志物。

图6蛋白质编码基因、lncRNA和miRNAs作为FGR的潜在标记

总之，这项研究全面剖析了人类脐带血的转录组全貌，构建了核心基因共表达网络，描绘了包括与FGR相关的印迹基因在内的关键基因特征，并提供了对子宫内扰动和FGR候选特征的关键见解。 然而，在妊娠早期对大样本量的诊断意义还需要进一步探索，并且需要进行功能和机理研究以为阐明FGR提供更多证据。

参考文献：

Wang Guiying., Yu Jun., Yang Yiwei., Liu Xiaoqin., Zhao Xiaobo., Guo Xudong., Duan Tao., Lu Chenqi., Kang Jiuhong.(2020). Whole-transcriptome sequencing uncovers core regulatory modules and gene signatures of human fetal growth restriction. Clin Transl Med, 9(1), 9. doi:10.1186/s40169-020-0259-0