抑制自噬增强了Nrf2促进小鼠糖尿病心肌炎

研究背景：

Nrf2能够改善或加重糖尿病心肌病，但是其潜在的机制却没有报道。Huimei Zang的等人在Diabetes（IF=7.72）这一杂志中发表文章，介绍Nrf2介导的1型糖尿病心肌损伤的新机制。

技术路线图：

研究结果：

1.心脏Nrf2在一型糖尿病伴心肌症中的调节作用

Nrf2敲除的小鼠中糖尿病相关死亡增加，而Nrf2KO改善空腹血糖和糖尿病相关体重的减少(Fig. 1A)。糖尿病发病6个月，Nrf2KO不影响心肌症紊乱的发生，但是减轻9月的病情进展(Fig. 1C)。另外，心肌肥大，细胞死亡，纤维化和氧化应激在中期和早期阶段能够被Nrf2KO所缓解(Fig. 2)。Nrf2KO小鼠2月-11月中出现病理性心脏生长比WT小鼠中较轻。为了避免其他因素干扰，比较了FS，BM和心脏重量/胫骨比例的变化。总的来说，Nrf2对一型糖尿病和相关死亡起到总体保护作用。但是它对糖尿病伴有心肌症的发展并没有保护或者延迟作用。相反，它可能以性别非依赖方式促进疾病的发展。在分子水平上，Nrf2可能增强糖尿病心脏的氧化压力，从而促进糖尿病心肌症的发展。

Fig.1

Fig.2

2.一型糖尿病中心肌自噬的抑制是不利的

CR-Atg5KO诱导心肌自噬抑制。心肌自噬流在3个月时是完整的，但是在糖尿病发病6个月时显著抑制，暗示在一型糖尿病中，高脂血症在抑制心肌自噬中的分担作用。接下来，在表达mCherry-Gfp-Lc3受体的H9C2心肌细胞样细胞中检测自噬流和自吞噬泡流出。因自噬溶酶体被红色荧光标记，自噬体被黄色荧光标记（红色和绿色）。H9C2细胞中基础自噬以自噬溶酶体居多和少量自噬体为主(Fig.3B)。表明大多数合成的自噬体不断与溶酶体融合形成自噬溶酶体，并进行降解。因此，溶酶体抑制剂BafA1用于控制自噬，来区分自噬体与溶酶体融合的数量。在H9C2细胞中，棕榈酸盐负担抑制了自噬特征通过损害自噬溶酶体流，并且在高糖环境中，脂质过量诱导的自噬抑制加重(Fig. 3B)。然而，CRAtg5KO导致心肌紊乱的早期发生，并随着时间的推移促进了它的发展(Fig.4A, 4C)。CRAtg5KO同样加速了糖尿病诱导的心肌病例改变，包括心肌纤维化，心肌肥大，细胞死亡和氧化应激(Fig. 4B-C)。另外，Atg5的敲除增强了H9C2细胞死亡，但是在脂质积累伴有高糖环境中没有改变，暗示抑制自噬是心肌细胞脂肪毒性和/或葡萄糖毒性的参与机制。结果表明随着时间进展，糖尿病通过抑制心肌自噬，诱导葡萄糖依赖的心肌细胞死亡，从而导致糖尿病心肌病的发病机制

Fig.3

Fig.4

3. 心脏自噬抑制是Nrf2介导的心肌损伤的关键因素

之后，我们研究了心肌自噬抑制对驱动Nrf2介导的心肌损伤的作用，并且是否能促进心肌症相关一型糖尿病的进程。选择糖尿病发病9个月的实验组，CR-Atg5KO增强了糖尿病诱导的心脏病理重塑和功能障碍(Fig. 5)。这些不良的表型被Nrf2KO所缓解。因为CR-Atg5KO本身不会影响糖尿病的状态。这些结果暗示自噬抑制-Nrf2激活-糖尿病中的心肌损伤和功能紊乱。

Fig.5

4. 在心肌症中，慢性一型糖尿病通过激活Nrf2诱导铁死亡

研究显示Nrf2在阿霉素诱导的铁死亡中可能有调节作用。在心肌细胞中，脂质过氧化物致死积累而产生的铁依赖形式的细胞死亡，通过上调心肌细胞中HO-1的表达。在糖尿病发生9月份，心肌铁沉积增加；CR-Atg5KO糖尿病诱导的铁沉积增强；然而NRF2敲除缓解了这两种增加(Fig. 6A-B)。Fig. 2E,5C显示铁死亡脂质过氧化的生物标记物与4HENE在糖尿病中的改变显示出相似的模式。这是Nrf2通过增强一型糖尿病铁沉积和脂质过氧化，促进心肌细胞铁死亡。敲除Nrf2选择性抑制高脂毒性在铁死亡抑制剂，Fer-1，铁螯合剂去铁胺(DFO)抑制糖脂毒性在H9C2细胞中(Fig. 6C-E)，提示一型糖尿病晚期发生的糖醛酸中毒驱动了nrf2介导的心肌细胞铁死亡。结果提示心肌细胞中存在慢性一型糖尿病-自噬抑制- nrf2激活-铁死亡的信号通路。

然后，我们发现在H9C2细胞中Nrf2敲除对铁死亡的作用。在保持自噬完整性的正常葡萄糖水平培养条件下，敲除Nrf2增加细胞死亡(图7A-B)。表明Nrf2对自噬功能正常的心肌细胞具有细胞保护作用。同样，敲除Nrf2(使Nrf2失活)抑制基础的和erastin诱导的Acsl4的表达，但是逆转了erastin诱导的Fsp1表达的抑制当上调基础表达(Fig. 7C)。这些结果显示Nrf2在抑制心肌细胞Fsp1的同时促进Acsl4的表达，在GPX4失活的情况下这种作用可能会加剧导致铁死亡。

一型糖尿病诱导的自噬抑制可能激活nrf2介导的心肌细胞铁死亡，从而促进糖尿病心肌病的进展。

Fig.6

Fig.7