研究思路探索：非编码RNA与巨噬细胞活化

导语：哮喘是儿童和成人最常见的慢性呼吸道疾病之一，其重要分子机制是炎症。巨噬细胞是肺内最丰富的免疫细胞，在以2型反应为主的过敏性哮喘中起重要作用。长链非编码RNAs(lncRNAs)的失调与多种人类疾病有关，在免疫系统的基因调控中发挥重要作用。非编码RNA与巨噬细胞活化的研究思路值得探索。

参考文献：Xia L , Wang X , Liu L , et al. Lnc-BAZ2B promotes M2 macrophage activation and inflammation in asthmatic children through stabilizing BAZ2B pre-mRNA[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2020. （IF: 10.228）

技术路线：

结果：

1. lnc-BAZ2B在哮喘儿童中上调

为鉴定哮喘儿童中差异表达的lncRNA，通过转录组芯片分析哮喘儿童和健康对照PBMCs中lncRNA和mRNA表达谱。发现719个lncRNA基因在哮喘患儿中存在差异表达，34个上调的非外显子正义lncRNA具有基因符号描述，选择5个使用RT-qPCR在另外50例哮喘患者和46例健康对照的PBMC样本数量中验证。分析哮喘患者PBMCs中mRNA表达谱，发现382个mRNA在哮喘患者中存在差异表达，基因本体富集分析发现2型免疫反应和2型免疫反应调节类别富集，表明2型免疫反应在过敏性哮喘中起重要作用。

评估PBMCs中T细胞、B细胞和单核细胞中LncRNA的表达，发现LOC643072主要在单核细胞中表达。LOC643072的表达在IL-4诱导的m2巨噬细胞活化过程中增强，在LPS诱导的M1巨噬细胞活化过程中下降。表明LOC643072可能在巨噬细胞活化中发挥重要作用。lncRNA LOC643072的序列定位在其顺式基因的反链上，与锌指结构域2B(BAZ2B)相邻的溴结构域，因此被命名为lnc-BAZ2B。

2. Lnc-BAZ2B促进M2巨噬细胞活化

为确定Lnc-BAZ2B是否调节巨噬细胞活化，评估了IL-4刺激后Lnc-BAZ2B功能丧失和获得对THP1来源的人巨噬细胞活化的影响。发现巨噬细胞中lnc-BAZ2B敲除显著损害了M2特异性标记基因的表达，包括CLEC7A、IL1RA、CCL18和IRF4。相反，巨噬细胞过表达lnc-BAZ2B时，M2特异性标记基因的表达水平显著增加。提示lnc-BAZ2B促进M2巨噬细胞活化。STAT6是IL-4信号通路中的主要转录因子， IL-4刺激STAT6敲除的M2巨噬细胞中lnc-BAZ2B的表达水平急剧下降。综上所述，提示IL-4通过STAT6活化诱导lnc-BAZ2B表达，然后促进M2巨噬细胞活化。

3. Lnc-BAZ2B通过增强BAZ2B表达促进M2巨噬细胞活化

研究lnc-BAZ2B对M2巨噬细胞活化的影响是否是由于其对BAZ2B表达的影响。lnc-BAZ2B敲除导致THP1来源的巨噬细胞中BAZ2B表达减少，而lnc-BAZ2B的过表达显著增加BAZ2B mRNA的水平。这些发现证实了lnc-BAZ2B可以正调控BAZ2B表达。IL-4刺激BAZ2B敲除的M2巨噬细胞表现出M2相关基因的表达显著降低。当BAZ2B被敲除时，lnc-BAZ2B的表达没有差异，表明lnc-BAZ2B是BAZ2B的上游调节因子。

当lnc-BAZ2B或BAZ2B/ Baz2b下调时，编码控制M2巨噬细胞活化的关键转录因子IRF4的表达水平显著降低，IRF4和M2巨噬细胞标记基因的水平随着lnc-BAZ2B的过表达而上调。在过表达lnc-BAZ2B的巨噬细胞中敲低IRF4的表达，观察到M2巨噬细胞相关基因的表达被逆转。这表明lnc-BAZ2B和BAZ2B主要通过上调IRF4促进M2巨噬细胞活化。由于BAZ2B是H3K14ac阅读器，使用抗H3K14ac抗体进行了ChIP实验，发现H3K14ac确实在IRF4启动子处富集。提示BAZ2B作为H3K14ac阅读器，主要通过上调IRF4的转录促进M2巨噬细胞活化。

4. Lnc-BAZ2B通过稳定pre-mRNA增强BAZ2B的表达

lnc-BAZ2B以35%:65%的比例在细胞核和细胞质中表达。
lncBAZ2B序列定位于其顺式基因BAZ2B的反链，lnc-BAZ2B的59末端与BAZ2B pre-mRNA的59末端互补。lnc-BAZ2B敲低后，BAZ2B前RNA和成熟mRNA的表达水平均显著降低，过表达lnc-BAZ2B的巨噬细胞中，BAZ2B和BAZ2B pre-mRNA的表达均上调。RNase保护试验发现当使用位于lnc-BAZ2B和BAZ2B互补区域的引物时，RNase A1T消化后仍可通过PCR扩增BAZ2B pre-mRNA。这些结果表明，lnc-BAZ2B和BAZ2B的pre-mRNA可能形成双链体，保护BAZ2B premRNA不被RNA酶降解。放线菌素D（转录抑制剂）处理巨噬细胞，发现随着lnc-BAZ2B的过表达，放线菌素D处理后巨噬细胞中BAZ2的降解慢。说明lnc-BAZ2B在转录后水平调控BAZ2B表达。提示lnc-BAZ2B和BAZ2B的pre-mRNA可以形成双链体，增加BAZ2B pre-mRNA的稳定性，进一步增加BAZ2B成熟mRNA的水平。

5. Lnc-BAZ2B和BAZ2B加剧CRE-诱导的肺部炎症

在CRE-诱导肺部炎症小鼠中出现哮喘病理学，炎症细胞显著募集至肺部，致密的支气管周围浸润和杯状细胞增生，CRE-处理小鼠中lnc-BAZ2B过表达显著增强肺部炎症，CRE处理的Baz2b敲低小鼠显示肺部炎症减少，浸润的炎性细胞减少，Muc5ac表达水平降低。

肺部炎症，比较不同组小鼠肺组织中小鼠M2巨噬细胞特异性标志基因的表达水平。发现CRE-处理小鼠中M2特异性标记基因的表达水平，包括Mrc1、Arg1、Clec7a和Irf4，增加，Baz2b mRNA表达高于PBS激发小鼠。这些结果表明lnc-BAZ2B和BAZ2B可以通过促进M2巨噬细胞活化加剧变应原诱导的肺部炎症。

6. 哮喘患儿PBMCs中Lnc-BAZ2B表达与BAZ2B表达相关

进一步验证lnc-BAZ2B和BAZ2B是否通过促进体内M2巨噬细胞活化加剧CRE-诱导的哮喘。测定过敏性哮喘儿童和健康对照受试者PBMCs中Lnc-BAZ2B和BAZ2B的表达水平，发现哮喘儿童中lnc-BAZ2B的表达水平显著高于健康儿童。在哮喘儿童中检测到lnc-BAZ2B和BAZ2B之间呈正相关。lnc-BAZ2B表达较高的哮喘患者的血嗜酸性粒细胞计数和百分比高于lnc-BAZ2B表达水平较低的患者。这些发现暗示lnc-BAZ2B有可能作为儿童哮喘的生物标志物。

总结：1.首次证明lnc-BAZ2B通过促进M2巨噬细胞活化增强过敏性哮喘的疾病严重程度。

     2. Lnc-BAZ2B通过双链体形成增强BAZ2B pre-mRNA的稳定性，BAZ2B增加M2巨噬细胞标记基因的转录。

     3. lnc-BAZ2B和BAZ2B在过敏性哮喘进展中至关重要，可作为儿童哮喘的潜在治疗和诊断靶点。