NRF2-LOC344887信号轴抑制肺纤维化
特发性肺纤维化(IPF)是一种进行性和不可逆的疾病。NRF2的药理学激活已被证明是一种有价值的抗纤维化方法，然而NRF2如何介导抗纤维化功能的详细机制仍不清楚。今天小编为大家带来发表于影响因子为9.986的杂志“Redox Biology”的文章“The NRF2-LOC344887 signaling axis suppresses pulmonary fibrosis”，带大家了解NRF2如何抗肺纤维化。我们的发现表明NRF2介导的LOC344887上调通过抑制CDH2和其他纤维化基因的表达有助于SFN的抗纤维化潜力，为NRF2如何控制特发性肺纤维化的调节网络提供了新的见解。
技术路线：
结果：
1）LOC344887是NRF2靶基因
为了确定肺细胞中可能受NRF2调节的lncRNAs，进行了人转录组阵列分析。有趣的是，阵列分析表明，与野生型相比，NRF2敲除细胞中lncRNA (LOC344887)的表达显著降低。野生型和突变型AREs的41-bp序列都被克隆到pGL4.22-荧光素酶载体中(图1A)。免疫印迹分析表明SFN诱导了NRF2(图1B)，并且在含有ARE1/2-WT的报告质粒转染的细胞中，相对荧光素酶活性只在SFN的作用下增加(图1C)。此外，NRF2-sMAF与ARE1和ARE2相结合结合 (图1D和E)。通过CHIP-qPCR进一步证实NRF2与LOC344887的ARE1和ARE2的内源性结合(图1F)。此外，与NRF 2+/+细胞相比，LOC344887的转录水平在NRF 2/-细胞中低得多(图1G)，并且在H1299和HFL1野生型细胞系中均被SFN显著增强(图1H)。重要的是，在NRF2缺失后或SFN处理后，LOC344887的表达模式与NQO1相似(图1G和H)。总的来说，这些结果表明LOC344887为肺细胞中的NRF2靶基因。
使用CRISPR/Cas9技术建立LOC344887敲除(KO) A549细胞系(图2A)。两对引物，一对定位于pac基因插入位点的上游(引物1)，另一对定位于下游(引物2)(图2A)用于qRT-PCR分析。已证实插入位点下游的LOC344887转录在LOC344887-KO细胞中没有发生(图2B)。进行RNA-seq分析来比较LOC344887-WT和LOC344887-KO细胞中全基因组的基因表达变化。结果显示，与LOC344887-WT细胞系相比，LOC344887-KO中733个基因上调，316个基因下调(图2C)。GO和KEGG分析表明，LOC344887的缺失导致许多参与纤维化过程的基因过表达，包括ECM重组和产生、ECM-受体相互作用和肌动蛋白细胞骨架的失调(图2D和E)。KEGG通路图显示PI3K-AKT信号通路可能与增强的纤维化过程有关(图2E)。在LOC344887敲除细胞中显著增加的转录物的热图显示了许多参与纤维化过程的基因的增强表达，例如ACTA2(编码α平滑肌肌动蛋白，α-SMA)、COL1A1(编码I型胶原的主要成分)和FN1(编码纤连蛋白)等(图2F)。
3）SFN的抗纤维化功能在很大程度上取决于LOC344887
为了证实LOC344887在控制肺纤维化中的作用，LOC344887-siRNA被用于敲除HFL1细胞中的LOC344887转录物。与图2所示的RNA-seq数据一致，LOC344887敲除在基因和蛋白质水平上增强了ACTA2/ α-SMA、COL1A1和FN1的表达(图3A–C)。接下来，评估LOC344887对先前报道的SFN抗肺纤维化治疗效果的贡献。为了在体外模拟纤维化，使用了纤维化活化剂TGF-β。在基础和TGF-β刺激条件下，SFN诱导NRF2表达并抑制ACTA2/ α-SMA、COL1A1和FN1的表达。然而，LOC344887敲除显著限制了SFN对基础和TGF- β刺激条件下这些蛋白表达减少的影响(图3D和E)。值得一提的是，虽然SFN对这些纤维化基因表达的影响在LOC344887敲除组中比对照组弱得多，但SFN对NQO1的诱导不受LOC344887敲除的影响(图3D和E)。
4）LOC344887基因敲除增加CDH2/N- cadherin的表达
另一个通过敲除LOC344887而上调表达的基因是CDH2，一种编码跨膜细胞粘附蛋白N-钙粘蛋白(N-Cad)的基因(图4A)。SiRNA介导的HFL1细胞中LOC344887的敲除证实了CDH2的转录上调(图4B)。当LOC344887被敲除时，N- Cad的蛋白质水平也得到提高(图4C和D)。由于据报道N-Cad与EMT有关，会导致肺纤维化，因此检测了N-Cad在纤维化基因表达中的重要性。CDH2的敲除导致ACTA2/α-SMA、COL1A1和FN1的表达降低(图4E和F)。更重要的是，LOC344887对这些基因表达的影响可以通过敲除CDH2来消除(图4G和H)。综上所述，LOC344887可能通过改变CDH2基因表达来调节ACTA2/α-SMA、COL1A1和FN1的表达。
5）LOC344887通过PI3K- AKT信号通路调节CDH2/N-cad的表达
KEGG分析表明，受LOC344887敲除影响最大的途径是PI3K-AKT信号途径(图2E)。事实上，在A549细胞中(图5A和B)和在HFL1细胞中敲除LOC344887 (图5C和D)增加了磷酸-AKT (Ser473)的水平，而不改变AKT的总水平。为了进一步证实PI3K-AKT信号通路在介导LOC344887缺失抗纤维化作用中的必要性，使用了PI3K抑制剂。LY294002不仅降低了磷酸-AKT、N- Cad、FN1、COL1A1和ACTA2/α-SMA的水平，而且完全消除了LOC344887增加这些蛋白的作用(图5E和F)。因此，PI3K-AKT信号似乎在介导LOC344887对CDH2、FN1、COL1A1和ACTA2/α-SMA表达的影响中起关键作用。
结论：我们的研究阐明了NRF2-LOC344887在抑制纤维化中的独特功能，并为治疗人类肺纤维化或其他纤维化疾病开辟了新的治疗途径。
参考文献：Liu, P., Luo, G., Dodson, M.,et al (2021). The NRF2-LOC344887 signaling axis suppresses pulmonary fibrosis. Redox Biology, 38, 101766. doi:10.1016/j.redox.2020.101766