NLRP3上调PD-L1参与淋巴瘤的免疫抑制

研究背景：肿瘤微环境(TME)中的慢性炎症使恶性细胞逃避宿主免疫监测，从而促进了肿瘤的发生。炎性小体在恶性细胞与TME的相互作用中发挥重要作用。NLRP3炎性小体在多种恶性肿瘤中起促瘤作用。然而，它在淋巴发育中的潜在作用尚不清楚。Fei Lu等人在Cancer Lett（IF= 7.36）这一杂志中发表文章研究NLRP3咋淋巴瘤中的预后作用及作用机制。

技术路线图：

研究结果：

1.淋巴瘤患者IL-18的水平升高，并且与肿瘤微环境中PD-L1的水平相关

应用微阵列分析了淋巴瘤肿瘤（DLBCL）和正常淋巴组织中效应细胞因子的水平，来评估NLRP3炎症小体在淋巴瘤微环境中的作用。在DLBCL中,IL-18水平升高（图1A）。具有非生发中心B细胞的患者中IL-18的水平更高（图1B）。如图1C，在CD10+和MUM1-患者中，IL-18和IL-1β的表达较低。而且，DLBCL组织中，PD-L1的表达更高（图1D），暗示患者不良预后。TME中PD-L1的表达与IL-18水平呈正相关(图1F)，这可能归因于NLRP3炎症小体的激活。图1G, OCI-LY3, RC和DB（淋巴瘤细胞系）中NLRP3炎症小体激活。NLRP3 抑制剂MCC950降低IL-1β和抑制PD-L1的表达。人DLBCL细胞系中NLRP3炎症小体激活，与PD-L1的表达相关，我们假设在恶性细胞和细胞毒性T细胞之间的相互作用中，NLRP3炎症小体的激活影响免疫反应。炎症小体NLRP3的激活减少CD8+T细胞的比例，而抑制剂降低这种作用（图1H）。表明NLRP3的激活在体外上调了B细胞淋巴瘤细胞的PD-L1水平，降低了细胞毒性T细胞，特别是在与免疫细胞长期相互作用后。

Fig.1

2.DLBCL病人中免疫抑制细胞增加

图2A所示，在DLBCL中，PD-1+，TIM-3+ T细胞水平显著升高。DLBCL病人患病严重时，T细胞中PD-1和TIM-3的水平较高（图2B）。高PD-1+细胞与血清中LDH的水平相关。然而，高表达PD-1+， TIM-3+ T细胞与DLBCL患者不良预后有关。DLBCL患者中循环MDSC和Tregs细胞增加。结果说明，DLBCL患者中的免疫抑制状态，表现为肿瘤中PD-L1高表达，PD-1+/TIM-3+ T细胞，MDSC和Tregs细胞增加。

Fig.2

3. NLRP3炎性小体阻断抑制淋巴瘤生长并减少PD-L1表达

在皮下注射同基因A20淋巴瘤细胞的小鼠中观察NLRP3炎性小体在B细胞淋巴瘤进展中的作用，肿瘤组织匀浆中，IL-18和IL-1β的水平升高（图3B）。MCC950显著减少了淋巴瘤的生长和抑制肿瘤发展（图3C-E）。MCC950降低了肿瘤组织和脾脏中活性caspase-1，活性IL-1β和IL-18的水平（图3F-G）。另外，MCC950抑制肿瘤中PD-L1的表达（图3F）。MCC950还降低了肿瘤中磷酸化的STAT3 (pSTAT3)水平，这表明阻断NLRP3炎症小体抑制STAT3激活，可能与PD-L1下调有关（图3F）。

Fig.3

4.NLRP3炎症小体阻断减少免疫抑制细胞的群体

PD-L1和 PD-1的相互作用是肿瘤免疫逃逸的关键。文章分析了荷瘤小鼠中不同免疫细胞群的比例，MCC950处理显著增加了肿瘤浸润性CD8+ T细胞和脾T细胞的比例(图4A)，以及TNF引起的CD3+和CD4+ T细胞的比例(图4B)。MCC950处理导致小鼠脾脏IFN诱导的CD3+和CD4+ T细胞显著减少(图4B);这可能是导致PD-L1下调的部分原因。此外，MCC950显著降低了脾脏和淋巴结中CD3+和CD4+ T细胞中PD-1的表达(图4C)。此外,MCC950治疗也减少了脾T细胞和CD4 + T淋巴细胞中TIM-3 (图未展示),MDSCs，TAM表达(图4 D和E),和Tregs在肿瘤组织和脾脏中的表达(图4F)。这些发现表明NLRP3炎症小体激活和免疫抑制之间有很强的相关性，并证明NLRP3炎症小体的阻断可以延缓淋巴瘤的进展。

Fig.4

5.体内阻断IL-18减少免疫抑制细胞的比例

进一步研究NLRP介导免疫抑制的机制。使用IL-1β和IL-18的中和抗体，肿瘤负担减轻(图5A)。IL-18的中和抗体处理的小鼠肿瘤浸润CD8+ T细胞和淋巴及循环CD8+ T细胞的百分比明显升高(图5B)。IL-1β的中和抗体仅提高了淋巴结中CD8+ T细胞的比例 (图5B)。

而且，在淋巴瘤小鼠中抑制IL-18导致淋巴结中PD-1+ CD3+ 和PD-1+ CD8+细胞的水平降低，以及外周血，脾脏，和肿瘤中PD-1 + CD4 +细胞比例减少。而IL- 1β抑制并不影响T细胞中PD-1表达(图5C)。抗IL -18抗体也下调了肿瘤浸润T细胞中TIM-3的表达，而抗IL-1β抗体增强了肿瘤T细胞中TIM-3的表达(图5D)。此外，抗IL -18和抗IL-1β抗体处理的淋巴瘤小鼠外周血中MDSCs和TAMs显著降低(图5E)。此外，IL-18中和作用降低了肿瘤和脾脏中treg的比例(图5F)。与mcc950处理小鼠的数据一致，接受IL-1β蛋白和IL -18处理的荷瘤小鼠肿瘤组织中PD-L1水平下调，pSTAT3水平降低(图5G)。综上所述，NLRP3炎性小体阻断可通过降低效应细胞因子IL-18介导的免疫抑制而至少部分地改善淋巴瘤进展。

Fig.5

6. NLRP3炎性小体阻断联合抗PD-L1治疗具有拮抗作用

使用MCC950或抗PD-L1抗体治疗的小鼠肿瘤负荷显著降低;然而，联合治疗降低了单独使用对肿瘤的抑制效果(图6B)。抗PD-L1治疗恢复了荷瘤小鼠的T细胞活性，表现为肿瘤浸润T细胞，特别是CD8+ T细胞数量的增加 (图6C)。虽然PD-L1阻断后脾脏T细胞的比例没有变化(图6C)，但脾脏中IFN-诱导的CD8+ T细胞和TNF诱导的T细胞比例显著增加(图6D)。联合治疗组肿瘤浸润CD8+ T细胞比例明显低于抗PD-L1单药治疗组(图6C)。联合治疗组脾脏CD3+、CD4+和CD8+ T细胞产生的IFN和TNF的水平也降低(图6D)。因此，NLRP3炎性小体的抑制可能破坏PD-L1阻断所导致的T细胞功能增强。PD-L1阻断后脾脏和淋巴T细胞上的PD-1水平显著升高(图6E)。此外，联合治疗组脾脏和淋巴T细胞上的PD-1和TIM-3表达均明显高于MCC950单药治疗组(图6E)。此外， PD-L1阻断和联合治疗均显著增加了肿瘤浸润性MDSCs(图6F)和TAMs(图6G)，但不影响肿瘤浸润性treg的比例(图6H)。因此PD-L1阻断部分抑制了MCC950在TME中的免疫刺激功能。

Fig.6