非酒精性脂肪肝炎的凶手-肝细胞焦亡

导语：非酒精性脂肪肝炎(NASH)是非酒精性脂肪肝的晚期疾病，肝细胞的脂毒性损伤可能是NASH发生的主要事件，可导致炎症，但NASH脂毒性的性质和机制尚不完全清楚。焦亡是新发现的一种程序性细胞死亡方式，参与各种病理进程。肝细胞焦亡是否是引发NASH的凶手之一呢？一起来看吧。

技术路线：

结果：

1. SMS1在HFHCD喂养的小鼠肝脏中表达增加
用高脂、高胆固醇饲料(HFHCD)喂食小鼠12周可诱导NASH，而喂食高脂饲料(HFD)的小鼠发生单纯性脂肪变性，无显著炎症和纤维化，HFHCD喂食小鼠中肝细胞凋亡明显，HFHCD显著增加鞘脂生物合成的关键因素-Spt2的表达，增加神经酰胺、SM和DAG的水平，并降低磷脂酰胆碱(PC)的水平，增加SMS1的肝脏表达，但未增加Sms2。这些表明，HFHCD喂养上调SMS1的表达。

2. FC诱导SMS1表达

检测蛋氨酸和胆碱缺乏饮食(MCDD)和西方饮食（富含脂肪、胆固醇和果糖）诱导的其他NASH模型中肝脏SMSs的表达。MCDD和Western饮食喂养小鼠肝细胞凋亡增加，SMS1表达增加，表明SMS1诱导是NASH的特征性表现，与肥胖无关。接受肝移植的NASH/肝硬化患者样本显示SMS1的高表达，SMS1的表达在脂肪变性受试者的肝脏标本中没变化。这些发现表明，较高的肝脏SMS1表达可能是NASH的共同特征。

胆固醇和SM共同富集在相同的膜结构域中，其浓度受到严格调控，以维持膜特性和信号通路。因此，检测游离胆固醇(FC)水平的增加是否诱导SMS1的表达。
喂食HFHCD、MCDD或西方饮食的小鼠肝脏中FC水平升高，小鼠喂食富含胆固醇的饲料，发现增加肝脏Sms1表达，但未增加Sms2。此外，用水溶性胆固醇和酰基辅酶a胆固醇酰基转移酶抑制剂Avasimibe（维持胆固醇未酯化形式）处理肝细胞，可显著增加Sms1表达，胆固醇和Avasimibe显著增加Sms1启动子活性，表明FC在转录水平诱导Sms1上调。综上所述，这些结果表明FC的积累刺激了NASH中Sms1的转录表达。

3. SMS1敲除阻止NASH的发展

为进一步阐明SMS1在NASH中的作用，检测了SMS1敲除在HFHCD喂养的小鼠中的作用。Sms1敲低改善了HFHCD诱导的肝脏炎症和纤维化，降低了单核细胞趋化蛋白-1(Mcp-1)、肿瘤坏死因子-α(Tnf-α)、转化生长因子-β1(Tgf-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-Sma)和III型胶原蛋白α1(Col3a1)的表达，降低血清丙氨酸转氨酶(ALT)的水平，但未显著改变肝脏甘油三酯水平（。因此得出结论，SMS1介导饮食诱导的肝损伤、炎症和纤维化，但不介导脂肪变性。

4. SMS1介导饮食诱导的肝细胞焦亡

接下来检测SMS1是否介导肝细胞焦亡。喂食HFHCD的小鼠中分离的肝细胞（HFHCD肝细胞）显示出SMS1蛋白水平升高和上清液中LDH释放增加。此外，HFHCD肝细胞中GSDMD-N水平升高，GSDMD-N是NASH中焦亡细胞死亡的关键因素，而坏死性凋亡标志物的磷酸化水平未发生变化。这些共同表明焦亡特异性地发生在HFHCD肝细胞中。这 些表明SMS1和HFHCD诱导的肝细胞焦亡之间联系紧密。来自焦亡肝细胞的条件培养基激活了LPS致敏的Kupffer细胞中的NLRP3炎症小体，增加IL-1β水平，肝脏Sms1敲低后抑制这种效应。

5. NASH动物肝细胞中NLRC4依赖性焦亡

在HFHCD喂食小鼠的分离肝细胞和肝脏提取物中，NLRC4的水平均显著较高，HFHCD肝细胞中NLRP3和NLRC4的表达增加。Sms1敲除并不影响NLRP3的表达，但消除了HFHCD介导的NLRC4磷酸化。敲除Nlrc4并不显著影响肝脏脂肪变性，但可预防NASH，并显著降低gasdermin-D活化和肝细胞死亡。Nlrc4敲除后HFHCD喂食小鼠的肝细胞上清液诱导LPS预处理的Kupffer细胞产生的IL-1β显著降低。由于DAG是由SMS产生的，可激活PKCδ，探索了SMS1和PKCδ激活之间的联系。PKCδ磷酸化在HFHCD喂养的小鼠肝细胞中较高，但在Sms1敲除的HFHCD喂养的小鼠中不高。此外，通过HFHCD喂食Pkcδ敲低小鼠可预防NASH，并显著降低NLRC4的磷酸化。这些发现强调SMS1和NLRC4通过PKCδ活化诱导肝细胞焦亡的联系。

6. Caspase-1基因敲除对小鼠肝细胞焦亡有保护作用，而Nlrp3基因敲除小鼠没有

研究NLRP3-caspase1轴在HFHCD诱导的NASH和肝细胞焦亡中的作用。Caspase-1和Nlrp3 K/O小鼠均可免受HFHCD诱导的肝脏炎症和纤维化，从喂食HFHCD的Caspase-1 K/O小鼠获得的肝细胞可预防焦亡。喂食HFHCD的Caspase-1 K/O小鼠的肝细胞条件培养基未能诱导LPS致敏的对照小鼠Kupffer细胞产生IL-1β，喂食HFHCD的Nlrp3 K/O小鼠肝细胞条件培养基诱导LPS致敏的对照小鼠Kupffer细胞产生显著的IL-1β。提示caspase-1，而非NLRP3，是HFHCD喂养诱导肝细胞焦亡的必要条件。

结论：1.肝细胞中的FC诱导Sms1表达，可阻止HFHCD诱导的NASH。
            2. SMS1产生的DAG通过依次激活PKCδ-NLRC4轴诱导肝细胞焦亡和NASH。

参考文献：Koh, E., et al., Sphingomyelin synthase 1 mediates hepatocyte pyroptosis to trigger non-alcoholic steatohepatitis. Gut, 2020. （IF=19.819）