RNA甲基化修饰（m6A）研究
RNA甲基化修饰（m6A）研究
RNA甲基化修饰约占所有RNA修饰的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）是高等生物mRNA和lncRNAs上最为普遍的修饰。目前发现microRNA，circRNA,rRNA, tRNA和snoRNA上都有发生m6A修饰。 m6A修饰主要发生在RRACH序列中的腺嘌呤上，其功能由“编码器(Writer)”、“消码器(Eraser)”和“读码器(Reader)”决定[1]。“编码器(Writer)”即甲基转移酶，目前已知这个复合物的成分有METTL3，METTL14, WTAP和KIAA1429；而ALKBH5和FTO作为去甲基酶（消码器）可逆转甲基化；m6A由m6A结合蛋白识别，目前发现m6A结合蛋白（读码器）有YTH结构域蛋白（包括YTHDF1, YTHDF2,YTHDF3， YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和 HNRNPC）。
m6A酶系统
METTL3是早先被鉴定为结合SAM的组件，其缺失引起小鼠胚胎干细胞、Hela细胞和HepG2 细胞中m6Apeaks的减少。METTL3及其同源蛋白METTL14定位在富含剪切因子的细胞核内亚细胞器－核小斑（Nuclear speckle）上，显示ｍ６Ａ修饰可能和ＲＮＡ的剪切加工相关。WTAP与METTL3–METTL14 二聚体相互作用，并共定位于核小斑，影响甲基化效率，参与mRNA剪。而KIAA1429作为候选的甲基转移酶复合体的新亚基，是整体甲基化进程所必须的[2]。FTO是ALKB家族的成员，作为第一个被发现的去甲基酶，可影响剪切因子SRSF2的RNA结合能力，进而调控pre-mRNA的剪切加工过程[3]。目前已发现FTO调节异常与肥胖、大脑畸形和生长迟缓相关， 揭示m6A可能对这些疾病具有重要的调节功能[4-6]。ALKBH5是ALKB家族中被发现具有去甲基作用的另一个成员，以RNase A敏感的方式与核小斑共定位，它可直接催化m6A-甲基化腺苷去除甲基而不同于FTO的氧化去甲基化[7].此外，ALKBH5和它的去甲基化活性影响新生mRNA合的成和剪切效率[7]， 且ALKBH5敲除雄性小鼠表现出精子发生异常，这可能是精子发生相关基因表达改变的结果[7]。m6A mRNA修饰执行其功能主要通过两个途径： 精细调控甲基化转录本的结构，以阻止或诱使蛋白-RNA 相互作用；或被直接由 m6A 结合蛋白识别，诱发后续反应。目前一类含有YTH功能结构域的蛋白被鉴定为m6A修饰的结合蛋白。其中YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3，YTHDC1和YTHDC2己被证实是ｍ６Ａ的结合蛋白.YTHDF1主要影响ｍ６Ａ修饰基因的翻译，YTHDF2主要影响ｍ６Ａ修饰基因的降解，而YTHDC1结合ｍ６Ａ修饰的基因后影响其剪接。HNRNPC是一种丰富的核RNA结合蛋白，参与pre-mRNA的加工[8]，且研究表明HNRNPC通过m6A与 RNA结合调控目标转录本的丰度和选择性剪切[9].
图 1 m6A修饰的酶系统[10]
m6A生物学功能
越来越多的证据表明m6A修饰在哺乳动物中发挥重要的生物功能。例如，在转录后水平上调控RNA的稳定性[11]、定位[12]、运输、剪切[13]和翻译[14]。Claudio R. 等发现依赖METTL3的pri-miRNA甲基化，会促进DGCR8识别和加工，从而促进microRNA的成熟[15]。此外，m6A识别蛋白 HNRNPA2B1促进 pri-miRNA 加工成 pre-miRNA[16]。另外，环状RNA上m6A的修饰能促进环状RNA的翻译[17]。m6A修饰在基因表达调控中起着重要的作用，其调控机制的异常可能与人类疾病或癌症相关。目前发现m6A可能会影响精子发育（ALKBH5，METTL3，Ythdc2）、发育（METTL3、FTO、ALKBH5）、免疫（METTL3）、UV诱导的DNA损伤反应（METTL3，FTO）、肿瘤生成（YTHDF2）或转移（METTL14）、干细胞更新（METTL14）、脂肪分化（FTO）、生物节律、细胞发育分化、细胞分裂及其它的一些生命过程。例如，ALKBH5敲除的雄性小鼠增加了mRNA中的m(6)A修饰，其特点是凋亡影响减数分裂中期的精子细胞，引起生育能力受损[7]。METTL3和METTL14增加弱精症精子的m6A水平[18]，在生殖细胞中，METTL3的敲除严重抑制精子分化和减数分裂的发生，转录组和m6A分析显示 精子发生相关基因的表达和选择性剪接发生了改变[19]。YTHDC2可促进靶基因的翻译效率，并降低其mRNA的丰度，在精子发生过程中起关键作用。当减数分裂开始时YTHDC2表达上调，YTHDC2敲除小鼠的生殖细胞没有经过偶线期的发育导致小鼠不育[20]。在DNA损伤反应中，METTL3可促进DNA聚合酶κ（Pol κ）与核酸剪切修复途径快速定位到UV引起的DNA损伤位点，当缺失METTL3时，细胞无法迅速修复UV照射引起的突变，并且对UV照射更加敏感[25]。在淋巴细胞性小鼠过继转移模型中， Mettl3缺陷通过影响mRNA m6A修饰，降低SOCS家族mRNA衰减，增加mRNA和蛋白表达水平，从而抑制IL-7介导的 STAT5活性和T细胞内稳态增殖和分化，进而抑制肠炎的发生[21]。在肝癌中，METTL14 通过调控pri-miRNA的m6A修饰，影响MiR-126的生成加工，从而抑制肝癌的转移[22]。在乳腺癌细胞中，低氧刺激能促进依赖低氧诱导因子HIF的ALKBH5的表达，而ALKBH5过表达降低了NANOG mRNA的m6A修饰，从而稳定mRNA提高NANOG的表达水平，最终增加乳腺癌干细胞所占的比例[23]。 此外，低氧诱导乳腺癌细胞中依赖ZNF217的NANOG 和KLF4 的mRNA m6A甲基化抑制，且ALKBH5敲除显著降低免疫缺陷小鼠乳腺癌的肺转移[24]。在肺癌中，METTL3能够促进肺腺癌细胞的生长、生存和侵袭，但还不清楚它是否作为 m6A 调节器或效应器发挥作用[25]。在急性髓细胞白血病（AML）患者中，m (6) A 调控基因的突变或拷贝数变化与TP53 突变存在密切联系，且m (6) A 调控基因的改变与AML不良预后相关[26]。此外，FTO在AML中高表达，它通过降低mRNA转录本中的m(6)水平，调节ASB2和RARA等靶点的表达，增强了白血病癌基因介导的细胞转化和白血病形成，并抑制全反式维甲酸(ATRA)诱导的AML细胞分化[27]。在脂肪形成过程中，FTO表达与m6A水平成负相关，促进脂肪形成[3]。在胶质细胞瘤样细胞中，ALKBH5通过lncRNA FOXM1介导FOXM1基因pre-mRNA上的m6A修饰维持胶质瘤细胞的成瘤性[28]。此外，甲基转移酶METTL3或METTL14的敲除，能够改变m6A的富集和ADAM19的表达，极大地促进了胶质瘤细胞的生长、自我更新和肿瘤形成[29]。
图2 m6A RNA修饰和介导的功能[30]
m6A 的研究方向
主要是通过研究 m6A修饰相关的甲基化、去甲基化酶和识别蛋白的功能，进而研究m6A修饰的生物学功能和作用机制：一般通过敲除m6A酶分子，研究下游功能基因分子的表达和m6A甲基化情况，通过介导相关基因异常（可变剪切、稳定性、翻译、miRNA 调控）影响细胞表型和功能特征。
m6A修饰图谱构建及作用机制：通过m6A甲基化测序（MeRIP-Seq, miCLIP）构建疾病细胞模型或者发病组织的 m6A 修饰谱，分析m6A的motif, peaks数量及分布，Peak 关联基因的特征，联合RNA-seq研究m6A甲基化与表达的关系。
m6A研究思路
方案一
方案二
研究案例
1、m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program. Cancer Cell 2017.(IF=27.4)
DNA甲基化异常是胶质瘤的表观遗传调控因子，但RNA甲基化在肿瘤包括恶性胶质瘤（GBM）中的调控还尚未清楚。为研究m6A调节可能导致GBM患者临床疗效不佳，作者通过TCGA数据库，发现ALKBH5在恶性胶质瘤样干细胞（GSCs）中高表达且与GBM 病人不良预后相关，干扰ALKBH5 降低GSCs细胞的自我更新能力且抑制GSCs增殖，进一步体内验证敲除ALKBH5可抑制肿瘤生长。
为研究ALKBH5的m6A作用机制，作者利用芯片和m6A-seq筛选到胶质瘤增殖相关的FOXM1，最后通过qPCR、WB、免疫荧光、核质分离WB/qPCR、RIP和MeRIP等实验证明ALKBH5通过去甲基化调节FOXM1在GSCs中的表达。
为研究ALKBH5对FOXM1的作用是否受其他因子的调节，作者研究了FOXM1的邻近基因，发现lncRNA FOXM1-AS与FOXM1序列互补，且共表达、共定位，进一步通过RIP, RNA pull down等实验证明lncRNA FOXM1-AS促进ALKBH5 和FOXM1初级转录本的相互作用。最后通过细胞实验进一步验证ALKBH5在lncRNA FOXM1-AS的作用下维持FOXM1的表达和细胞增殖，从而维持GSCs的干性。
图3 ALKBH5敲除细胞中m6A修饰的特征和基因表达的变化
2、RNA N6-methyladenosine methyltransferase METTL3 promotes liver cancer progression
through YTHDF2 dependent post-transcriptional silencing of SOCS2. Hepatology,2017.(IF=13.2)
表观遗传改变极大地促进了人类癌症的发生。传统的表观遗传研究主要集中在DNA甲基化，组蛋白修饰和染色质重构。最近，RNA各种可逆的化学修饰被认为是一种新的表观遗传调控方式。m6A是真核生物mRNA最常见的化学修饰，在调控mRNA稳定性，剪切和翻译方面具有重要的作用。
作者使用转录组测序发现了METTL3（甲基转移酶3），一种主要的RNA N6-腺苷-甲基转移酶，在人肝细胞癌（HCC）和多种实体肿瘤中显著高表达。在临床上，METTL3的过度表达与肝细胞癌患者不良预后有关。体外实验证明敲除METTL3会显著抑制HCC细胞增殖，迁移及克隆形成。体内实验证明敲除METTL3会明显抑制HCC体内成瘤和肺转移。另外，使用CRISPR/dCas9-VP 64激活系统，内源性高表达METTL3会显著促进HCC细胞在体外和体内生长。通过转录组测序、m6A-Seq、MeRIP-PCR，作者确定了SOCS2（细胞因子信号2的抑制因子）作为METTL3介导的m6A修饰的下游靶基因。 敲除METTL3表达会消除SOCS2 mRNA m6A修饰并增强SOCS2 mRNA表达。m6A介导的SOCS2 mRNA降解是依赖于m6A“读取器”蛋白YTHDF2。总之，METTL3在HCC大部分高表达中,并通过m6A-YTHDF2依赖机制抑制SOCS2表达从而促进HCC进展。因此，作者发现了在肝肿瘤发生过程中表观遗传改变的一种新机制。
图4 RNA甲基化转移酶METLLT3在肝癌组织中高表达
（转录组测序结果及TCGA数据库分析）
图5 RNA-Seq和m6A-seq联合鉴定SOCS2是METTL3
介导的m6A修饰的下游靶基因
3、N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One 2015,
在许多不同种类的RNA中，都已观察到N6 -腺苷(m6A)的甲基化，但其在microRNAs中还没有被研究。研究者在FTO1C1, FTO2D4 和 FTO3C3细胞系中，通过敲除m6A甲基转移酶FTO筛选到表达差异的microRNA,说明miRNA受m6A甲基化的调控。进一步通过MeRIP-Seq发现相当一部分的microRNA具有m6A修饰。通过motif分析，他们发现了区分甲基化和非甲基化microRNA的一致序列。该文章所述的表观遗传修饰在基因表达的转录后调控的复杂性上增加了一个新的层次。
图6 FTO敲除对甲基化的miRNAs的稳定状态的影响。
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