细胞外囊泡蛋白分析用于监测和预测转移性乳腺癌的治疗反应

2021年5月，北京生物纳米技术工程研究中心，国家纳米科技中心，中国科学院大学未来技术学院，中国人民解放军总医院第五医学中心乳腺癌科和中国人民解放军总医院第二医学中心检验科团队合作在Nature communications（IF=12.121） 杂志上发表了文章“Protein analysis of extracellular vesicles to monitor and predict therapeutic response in metastatic breast cancer”。此报道探索EV蛋白标记物在MBC诊断、治疗反应监测和使用TAS平台的预后预测中的效用。设计了一种机器学习算法基于8个乳腺癌相关EV蛋白 marker的表达水平来识别EV signature。EV signature提供了较高的准确性来区分MBC与非转移性乳腺癌(NMBC)和健康供体(HD)，并在培训、验证和前瞻性队列中监测MBC治疗反应。EV signature也与接受治疗的MBC患者的无进展生存期(PFS)相关。

转移性乳腺癌(MBC)是一种异质性疾病，包括多个不同的亚型，仍然是世界范围内女性癌症死亡的主要原因之一。对于MBC患者，实时监测和预测治疗反应对于最佳个性化治疗方案至关重要。虽然组织活检已被用于MBC的诊断，但其侵袭性带来了风险和发病率，患者在进展时可能没有足够的组织可供4。计算机断层扫描(CT)串行成像在监测治疗反应时敏感性降低，不能用于预测疾病进展。因此，迫切需要可靠的、无创的MBC诊断、监测和预后工具。

通过以微创和可重复的方式分析循环肿瘤相关生物标志物，血液检测为MBC管理提供了一个有吸引力的替代方案。癌抗原15-3 (ca15 -3)是MBC监测中最广泛使用的血浆/血清生物标志物，但其反应仅在一半的患者中与疾病反应相一致。循环肿瘤细胞(CTCs)和循环肿瘤DNA (ctDNA)的定量和遗传特征与肿瘤负荷监测的放射学测量具有良好的一致性，可预测MBC患者的疾病进展和生存。然而，由于外周血中ctc和ctDNA的丰度较低，ctc和ctDNA的分析往往需要大的采样量和复杂的方法才能达到满意的灵敏度。

肿瘤来源的细胞外囊泡(EVs)最近作为一种重要的循环生物标志物出现在癌症诊断中。EVs结合蛋白已被证明在BC进展和转移的关键过程中发挥重要作用，包括肿瘤血管化，靶向治疗耐药性，基质重塑，免疫逃逸和转移前生态位形成。因此，血液中EV蛋白标记物的连续取样可能有助于MBC的诊断和监测，但仍有待临床队列研究的发现。

离心分离EV，缺乏超灵敏和特异性的检测方法，不受非囊泡污染的干扰。为了直接应对上述挑战，我们之前开发了一种直接、敏感、经济有效的热电泳适体传感器(TAS)来测定癌症患者血清EV的表面蛋白谱，而不需要预先分离EV。TAS的工作原理是依赖于大小依赖的热电泳富集(103倍)适配体结合EV，产生放大的荧光信号，其强度指示EV表面蛋白的表达水平。应用机器学习算法，定义了7种蛋白质标记物的EV签名，用于6种不同癌症类型的早期检测和分类。

技术路线：

一、热泳适体传感器（Thermophoretic aptasensor ）用于EV蛋白标记物的敏感分析

A-C. TAS平台用于分析ev上的特异性蛋白，具有临床可行性(图1)。临床血浆样本(1 L，)与cy5偶联的适配体孵育2小时，使适配体能够与靶EV蛋白结合(补充表2和3)。使用适配体而不是抗体进行蛋白检测具有更高的热稳定性和成本效益。然后，将孵育后的样品进行10分钟的局部激光加热，以获得大小相关的ev热泳积累(模式尺寸约为100 nm)，以放大适体结合ev的荧光信号。

D. 小尺寸(几纳米大小)的可溶性蛋白不能被TAS积累和检测，因为它们的耐热性较弱.

从ev衰竭血浆(样本i)中发出的荧光信号很弱，与加入可溶性蛋白如ca15 -3 (25 U mL 1)、ca125 (35 U mL 1)或CEA (5 ng mL 1)(样本ii)的ev衰竭血浆中的荧光信号相似。

相比之下，在样品iii中观察到荧光强度增加了4倍，该样品iii是通过将来自未治疗MBC患者(2 109 mL 1)的血浆ev注入样品ii中制成的(图1d)。

E.   TAS可以检测EV蛋白标记物，而不受可溶性对应物的干扰。TAS对ev的检出限为3.8 ×10⁷ mL ^-1 (LoD，高于空白值3个标准偏差)，是ELISA的10²倍。

F.   G. 通过测量不同BC细胞系(BT-474、SK-BR-3和MDA-MB- 231)和良性乳腺上皮细胞系(MCF-10A)上8种蛋白标记物的表达水平来表征TAS的性能。不同细胞系ev的数量用NTA定量，实验中ev的数量相同(10¹⁰ mL ^-1).

二、乳腺癌患者的EV蛋白谱

A.   B. 在EV为基础的癌症诊断中，收集了36例MBC患者抢救治疗前、21例NMBC患者手术治疗前和66例年龄匹配的HD患者的123份血浆样本。8种蛋白标记物在血浆ev上的表达模式由TAS检测。热泳积累后，适体标记EV的荧光图像反映了MBC或NMBC患者的8种EV标记物水平高于HD患者.

C.D MBC和NMBC患者EV蛋白标记物表达均存在显著异质性。PrecisionRecall Curves (PRC)显示，EV上的ca15 -3和EpCAM对BC和HD具有较高的区分能力.

E.F只有58.3%的MBC患者(21 / 36)和14.3%的NMBC患者(3 / 21)显示血浆CA 15-3水平升高。此外，我们的数据显示任何一对EV蛋白标记物之间的相关性较弱(Pearson中值相关系数r = 0.31，图2f)，以及EV上血浆ca15 -3和ca15 -3之间的相关性较弱(r = 0.29，图2f)

三、建立EV^DX signature用于MBC诊断

为了提高EV在区分MBC、NMBC和HD组方面的性能，我们利用机器学习方法来编译所有EV蛋白标记物谱.

A.   B. EV^DX signature,  代表了通过线性判别分析(LDA, Supplementary Software)识别的 CA 15-3, CA 125, CEA, HER2, EGFR, PSMA, EpCAM, 和VEGF 信号。

C.EV^DX signature在三个类别上的总体准确率为91.1%.

D.8个EV蛋白标记的未加权和(sum)与EV^DX标记相比，总体准确性较低，为79.7% (95% CI = 71.5 86.4%)(补充表6 8)。分级聚类分析未发现MBC患者按转移部位进行分离(图3d)。

E.   MBC肺转移患者EVs中EGFR的表达较高.

F.   在MBC患者中，针对肿瘤大小的EV签名显示出与3到5个最大可测量病变的肿瘤大小之和有良好的相关性。在NMBC患者中，EVTS特征也与原发肿瘤大小相关.

四、监测MBC治疗反应的EV^M signature

评估了在治疗14个周期后从MBC患者中收集的112份血浆样本中EV蛋白谱监测治疗反应的能力

A.   总结了部分缓解(PR, n = 18)、稳定(SD, n = 17)和进展(PD, n = 10)患者(RECIST, version 1.1) EV蛋白标记物表达水平的相对变化(ΔIntensity) .

B.   C. EV^M signature 定义为 LDA对8个标记ΔIntensity的加权和以及显示的曲线下面积(AUC)为0.9429。通过受试者工作特征(ROC)分析区分PD和PR/SD的准确性为88.9% (95% CI = 76.0 96.3%)。

C.   验证组包括患者血浆样本MBC保持40%,维生素与签名实现了AUC为0.9066

A-C.在35个血浆样本的前瞻性队列中，使用训练过的LDA模型生成的EVM签名在PD (n = 7)和PR/SD (n = 20)之间的区分准确率达到了85.2% (95% CI = 66.3 95.8%).

D-E.在培训、验证和前瞻性队列中，当应用于不同的BC亚型时，EVM签名在对治疗反应进行分类方面表现出相似的性能(AUC = 0.9444，激素受体阳性(HR +)的95% CI = 0.8681 1.0000;人表皮生长因子受体2阳性(HER2 +)的AUC = 0.8674, 95% CI = 0.7307 1.0000;三阴性乳腺癌(TNBC)的AUC = 0.9026, 95% CI = 0.7662 1.0000.

五、MBC纵向监测的EV^M signature

在纵向研究中，我们比较了EV^M特征和血浆ca15 -3在监测至少有三个治疗点的MBC患者对系统治疗的反应方面的表现。
在不同的BC亚型中，EVM特征比血浆ca15 -3能更好地捕捉肿瘤负荷的变化。

PR (P124)在0 ~ 2时EVM信号水平下降，而血浆ca15 -3浓度略有升高。对于HER2 + MBC患者(P112)和转移性TNBC患者(P45)伴有PD的患者，EVM特征水平升高。

在PD发生时血浆ca15 -3浓度保持不变甚至下降。血浆CA 3和治疗反应之间的一致性为80%时观察到的最大血浆CA 3水平高于阈值的两倍(50 U mL ^-1)，而一致性下降到61.8%时最大血浆CA 3水平was< 50 U mL ^-1

六、EV^P信号用于预测MBC无进展生存

研究人员对59例正在接受治疗的MBC患者的EV蛋白谱预测临床结果的性能进行了研究

A. 在Kaplan Meier分析中(log-rank检验:P = 0.028)，高水平(中位数以上)的EVP特征(LDA对8个标志物的基线强度加权和)与较差的无进展生存期(PFS)显著相关(图7a)。EVP值较低时，中位无进展生存期为475天。

B-I.血浆ca15 -3在同一队列中没有显示预后价值(log-rank检验:P = 0.23;单因素Cox回归:HR = 0.5, 95% CI = 0.2 1.6, P = 0.239;多因素Cox回归:HR = 0.7, 95% CI = 0.2 2.5, P = 0.6176;补充图6)。我们还注意到，最好的EV蛋白标记物PSMA单独与PFS相关，且具有统计学意义(log-rank检验:P = 0.015)，并作为PFS的独立预测因子(单因素Cox回归:HR = 4.0, 95% CI = 1.2 13.1, P = 0.0237;多因素Cox回归:HR = 4.1, 95% CI = 1.2 14.1, P = 0.0277)。