circMAPK1编码的一种新的蛋白MAPK1-109aa参与胃癌的进展

circRNA是一种新型的非编码RNA，已被报道通过多种机制参与疾病的发生和发展。MAPK通路是一种常见的信号转导通路，参与细胞增殖、炎症和凋亡，在癌症中起着特别重要的作用。然而，与MAPK通路相关的circRNA在胃癌中的作用尚未被探索。因此，小编为大家带来一篇于2021年4月发表于影响因子为15.302的杂志Molecular Cancer上的文章“A novel protein encoded by circMAPK1 inhibits progression of gastric cancer by suppressing activation of MAPK signaling”。在本研究中，我们发现circMAPK1在胃癌组织中较邻近正常组织表达下调。重要的是，较低的circMAPK1表达预示着GC患者较差的生存。CircMAPK1在体内外均能抑制胃癌细胞的增殖和侵袭。接下来，我们发现circMAPK1编码了一个长度为109个氨基酸的新蛋白。通过一系列功能实验，我们证实了circMAPK1通过编码的蛋白MAPK1-109aa发挥了抑制肿瘤的作用。在机制上，肿瘤抑制因子MAPK1-109aa通过竞争性结合MEK1来抑制MAPK1的磷酸化，从而抑制MAPK1及其下游因子在MAPK通路中的激活。

技术路线

结果：

1）circMAPK1的鉴定和circMAPK1的临床特征

由于MAPK信号通路在肿瘤发生和进展中起着重要的病理作用，我们首先根据在线数据库circBase中的circRNA测序数据分析了来自MAPK通路相关基因的circRNA。然后我们清点了MAPK 通路相关的circRNAs，发现大部分细胞系可以表达数以百计的MAPK通路的circRNAs(图1a)。在来源于MAPK1的circRNA中，circ-0006203、circ0004872和circ-0008870在超过三个独立的测序数据集中被广泛检测。我们利用qRT-PCR检测了这三种circRNA在胃癌患者的胃癌组织和癌旁组织中的表达水平(图1b)。结果显示circ-0004872的表达变化最为显著。circ-0004872在癌组织/细胞中的reads明显低于正常组织/细胞(图1c)。此外，GSE121445和GSE100170数据库中也证实了GC中circMAPK1的下调(图1d)。这些数据提示circ-0004872具有潜在的抑制作用，从而促使我们进一步研究其在胃癌恶性肿瘤中的作用。

Circ-0004872(本研究称为““circMAPK1”)来自MAPK1基因的第2-4个外显子，形成一个490 nt的重叠环状转录本(图1e)。Sanger测序证实了扩增的circMAPK1的头尾剪接(图1f)。接下来，我们研究了circMAPK1在GC细胞系中的表达水平。如图1g所示，与正常的胃粘膜上皮细胞系相比，培养的GC细胞系中circMAPK1表达显著下调。另外，circMAPK1仅从cDNA中扩增，而不是从gDNA中扩增(图1h)，说明circMAPK1的环结构是由back-splicing产生的。然后我们进一步评估了circMAPK1的稳定性和定位。经过放线菌素D处理后，circMAPK1的半衰期明显长于线性MAPK1(图1i)。与MAPK1 mRNA的线性形式相比，circMAPK1对RNase R的降解具有抗性(图1j)。随后的细胞组分qRT-PCR分析(图1k)和荧光原位杂交分析(图1l)显示，circMAPK1主要定位于细胞质而不是细胞核。

由于circMAPK1在GC细胞系中稳定表达，我们推测circMAPK1可能是一种适合GC诊断或预后的标志物。qRT-PCR显示circMAPK1在癌组织中的表达低于匹配的非癌组织(图1m)。Kaplan-Meier生存分析显示胃癌组织中circMAPK1水平较高的患者总生存期显著延长(图1n)。综上所述，circMAPK1是一种稳定表达的circRNA，可作为有效的诊断和预后标志物，值得进一步研究。

2）CircMAPK1在体外抑制GC细胞的增殖和迁移

为了研究circMAPK1在GC中的生物学功能，我们进行了一系列细胞实验。随CCK8实验(图2a)、集落形成实验(图2b)和EdU实验(图2c) 结果表明，沉默circMAPK1可显著增强GC细胞的增殖能力。我们发现circMAPK1的减少增加了S期GC细胞的数量(图2d)。Transwell(图2e)试验显示circMAPK1的干扰促进了GC细胞的迁移。此外，过表达circMAPK1显著削弱了GC细胞的增殖能力。同样，过表达circMAPK1时，S期GC细胞的数量显著减少，细胞迁移受到抑制。综上所述，circMAPK1在GC细胞的增殖和迁移中起着重要作用。

3）CircMAPK1在体内抑制胃癌的发生和转移

为了进一步证实体外研究结果，我们在体内验证了circMAPK1在影响致瘤性方面的生物学作用。circMAPK1的沉默可显著促进肿瘤的生长。相比之下，过表达circMAPK1显著抑制了皮下肿瘤的生长(图3a)。接下来，我们通过对增殖细胞标记物Ki67的染色来监测异种移植瘤的增殖。稳定敲除circMAPK1的肿瘤组织表现出更强的Ki67染色，而过表达circMAPK1的肿瘤组织表现出更弱的Ki67染色(图3b和c)。为了研究circMAPK1在体内的转移潜能，我们用荧光素酶质粒稳定地转染上述细胞系，然后注射到裸鼠的尾静脉中。结果显示，circMAPK1的敲低有效地增加了肺转移病灶的数量和大小。相比之下，生物发光成像(图3d和e)和H&E染色(图3f和g)显示，过表达circMAPK1减少了肺转移病变。

4）CircMAPK1编码109个氨基酸的新蛋白MAPK1-109aa

根据在线数据库circRNADb的预测结果，circMAPK1序列中包含一个开放阅读框，起始密码子为ATG，IRES位于274-327 nt。这一观察结果表明circMAPK1具有编码109aa蛋白的潜能，本研究将其命名为MAPK1-109aa(图4a)。为了验证预测的IRES在circMAPK1中的活性，我们进行了双荧光素酶检测，结果显示野生型IRES报告基因的荧光素酶活性明显高于突变型IRES报告基因的荧光素酶活性(图4b)。为了进一步证实MAPK1-109aa的存在，我们将circMAPK1 IRES突变质粒和circMAPK1过表达质粒转入HEK293T细胞。银染色结果显示，在分子量为13 kDa时存在明显的蛋白带，与MAPK-109aa的预测大小一致。MS检测到AMEIMLNSKLCL序列，与MAPK1-109aa含有特定C端序列LCL的氨基酸序列一致(图4c)。为了检测该多肽产物，我们使用了一种识别MAPK1中间部分的抗体(图4d)。Western Blot检测40对胃癌组织(图4e)和细胞系(图4f)中MAPK1-109aa和MAPK1的水平。通过半定量分析，胃癌组织中MAPK1-109aa水平较正常胃组织中降低。Kaplan-Meier生存分析显示，MAPK1-109aa表达水平较高的胃癌患者总生存期明显长于MAPK1-109aa表达水平较低的胃癌患者(图4h)。一系列GC细胞系中MAPK1-109aa的含量也明显低于正常胃粘膜细胞系GES-1。在内源性circMAPK1水平较低且几乎没有MAPK1-109aa表达的MKN45细胞中，转染circMAPK1和MAPK1-109aa质粒均产生预测的MAPK1-109aa带，而过表达circMAPK1 IRES突变质粒则没有产生预测的MAPK1-109aa带(图4i)。相反，在内源性circMAPK1和MAPK1-109aa更高表达的GES-1细胞中，发现两种特异性靶向circMAPK1连接的shRNA显著降低了MAPK1-109aa的表达(图4j)。使用anti-flag抗体进行免疫荧光检测，证实MAPK1-109aa-Flag位于过表达MAPK1-109aa-Flag质粒的MKN45细胞的胞质中，如图4k所示。

5）MAPK1-109aa对胃癌有抑制作用

为了进一步研究MAPK1-109aa的生物学功能，我们将circMAPK1 ATG突变质粒、circMAPK1 IRES突变质粒和circMAPK1过表达质粒转染到MKN45和BGC823细胞中。如预期的那样，当转染ATG突变质粒和IRES突变质粒时，没有出现circMAPK1编码的MAPK1-109aa 13-kDa带(图5a)。CCK8实验(图5b)、集落形成实验(图5c，d)和EdU实验(图5e，f)显示过表达circMAPK1明显抑制了细胞的增殖能力。流式细胞术显示，处于S期的GC细胞数量也明显减少(图5g)。然而，当circMAPK1的ATG或IRES序列发生突变时，MKN45和BGC823细胞的增殖能力没有明显变化。同样，Transwell实验(图5h)也证明了肿瘤细胞的迁移能力。综上所述，circMAPK1在没有其编码蛋白MAPK1-109aa的情况下，不能抑制GC细胞的恶性表型。随后，为了进一步验证MAPK1-109aa的功能，我们在SGC7901和MGC803细胞中恢复了MAPK1-109aa的表达，无论是否稳定敲除circMAPK1，Western blot验证了这一点(图6a)。将MAPK1-109aa质粒转染到SGC7901和MGC803细胞株后，细胞的增殖能力(图6b-g)和迁移能力(图6h)得到了有效的抑制。在转染了shcirMAPK1的细胞系中，恢复了MAPK1-109aa的表达也逆转了稳定敲除circMAPK1所导致的恶性表型。综上所述，上述结果表明circMAPK1对GC细胞恶性生物学行为的抑制作用依赖于其编码蛋白MAPK1-109aa。

6）MAPK1-109aa通过竞争性结合MEK1来抑制MAPK1的磷酸化

为了研究MAPK1-109aa抑制GC的分子机制，我们将标记的MAPK1-109aa质粒转染HEK293T细胞。在flag标记的MAPK1-109aa免疫沉淀复合物中，潜在的相互作用蛋白被拉下(图7a)。采用蛋白MS分析对差异表达蛋白进行鉴定。在被识别的蛋白质列表中，丰度最高的蛋白质是MEK1，表明MEK1是MAPK1-109aa潜在的相互作用蛋白(图7b，c)。此外，flag标记的MAPK1-109aa可以与MEK1相互作用，证实了MAPK1-109aa与MEK1之间的直接相互作用(图7d)。免疫荧光染色显示MAPK1-109aa与MEK1共定位(图7e)。此外，我们采用MEK1抗体免疫共沉淀，探讨MAPK1-109aa对MAPK1通路的潜在调控作用。我们发现，在circMAPK1稳定下调的SGC7901和MGC803细胞中，与对照组相比，MAPK1-109aa与MEK1的结合明显减少，而MAPK1与MEK1的结合增加(图7f)。在MKN45和BGC823细胞中，IRES突变时MAPK1-109aa不翻译。因此，MAPK1与MEK1的结合没有明显变化。然而，过表达circMAPK1后，MAPK1与MEK1的结合显著减少，而MAPK1-109aa与MEK1的结合显著增加(图7g)。因此，以上结果表明MAPK1-109aa与MAPK1竞争结合MEK1。随后的Western blot结果也证实，在过表达circMAPK1的细胞系中，MAPK1-109aa显著升高，磷酸化的MAPK1/2降低，而在circMAPK1敲低的细胞中则相反(图7h)。此外，MAPK1的下游效应因子，如p-ELK1、p-c-Fos、p-c-JUN和p-RSK，也被过表达的circMAPK1显著抑制(图7i)。这些结果表明，circMAPK1编码的MAPK1-109aa通过抑制MAPK1信号通路发挥抑癌作用。

MAPK级联是人类癌症最重要的致癌驱动因子之一，通过靶向抑制剂阻断这一信号通路是一种重要的抗肿瘤策略。因此，我们用MAPK通路抑制剂PD0325901处理SGC7901和MGC803细胞。Western blot显示，PD0325901的加入显著降低了MAPK1通路下游因子的激活。而添加PD0325901后，MAPK1-109aa的表达水平没有明显变化(图8a)。集落形成(图8b，c)、EdU(图8d，e)和Transwell实验(图8f)结果表明PD0325901处理后细胞的增殖和迁移能力明显受到抑制。此外，在抑制剂存在的情况下，将shcircRNA转染到SGC7901和MGC803细胞中，目的是部分提高MAPK通路的活性。然而，当细胞与PD0325901共同处理时，抑制circMAPK1没有明显的促癌作用(图8b-f)。综上所述，这些结果证实了MAPK1-109aa通过与MEK1竞争相互作用抑制MAPK1的磷酸化，通过抑制MAPK通路发挥肿瘤抑制作用。

结论

我们在胃癌中发现了一种来自MAPK1的下调circRNA。MAPK1-109aa由circMAPK1编码，通过与MAPK1竞争与上游激酶MEK1结合发挥抗癌作用，抑制MAPK1磷酸化和下游致癌因子。我们的研究结果提示circMAPK1可能作为GC的治疗靶点，也为MAPK通路激活引起的疾病提供了新的治疗思路。