助纣为虐的外泌体调节巨噬细胞极化促进乳腺癌转移

巨噬细胞的差异激活与肿瘤进展密切相关，而表观遗传因子赖氨酸去甲基化酶6B (KDM6B，先前命名为JMJD3)通过一种未知的机制调节巨噬细胞的极化。本文探讨了该调解机制及其功能，并于2021年5月发表在《Theranostics》IF:8.579期刊上。

技术路线：

主要实验结果如下：

1、巨噬细胞KDM6B的表达被miR-138-5p抑制

根据文献报道KDM6B是巨噬细胞的激活的关键分子，因此，作者首先检测了乳腺癌细胞系MB-MDA-231对巨噬细胞系TPH-1中KDM6B表达的影响，结果表明乳腺癌细胞及其条件培养基都可显著下调KDM6B的表达，表明存在一种乳腺癌细胞来源的分泌因子产生此种影响。因此，通过生物信息学预测了KDM6B结合的miRNA，以及结合文献，通过在乳腺癌中上调的，同时符合条件的有3个。随后将乳腺癌细胞和巨噬细胞共培养，检测三个miRNA的表达，如图1B所示，只有miR-138-5p和miR-146a的表达在共培养后显著上调。进一步检测发现，只有miR-138-5p处理后KDM6B的表达显著下降而非miR-146a（图1C-D）。生信分析预测了miR-138-5p和KDM6B的结合位点，并进行了荧光素酶实验检测，证实了两者间存在结合关系。

图1 miR-138-5p抑制巨噬细胞KDM6B的表达

2、miR-138-5p介导癌细胞诱导的巨噬细胞KDM6B表达抑制

构建了miR-138-5p过表达的乳腺癌细胞系，取其培养基与巨噬细胞共培养，结果巨噬细胞中miR-138-5p表达显著上调，同时KDM6B的表达显著下降。证实miR-138-5p介导癌细胞诱导的巨噬细胞KDM6B表达抑制。

图2 miR-138-5p介导癌细胞诱导的巨噬细胞KDM6B表达抑制

3、癌细胞来源的外泌体miR-138-5p下调KDM6B的表达

随后为了判定上述巨噬细胞中miR-138-5p表达上调的原因，检测了巨噬细胞中原代(pri-)和前体(pre-) miR-138的水平。结果显示共培养和对照组间原代和前体miR-138的水平没有差异，表明miR-138-5p是外源供应的（图1A）。此外，使用RNase A处理miR-138-5p水平不变，使用Triton X-100其水平显著下降。提示miR-138-5p被膜状结构包裹（图1B）。进一步分析表明使用外泌体抑制剂GW4869处理组和外泌体删除组的培养基中miR-138-5p的表达显著下降（图1C）。表明外泌体来源于乳腺癌细胞。类似的，外泌体抑制剂GW4869处理导致共培养的巨噬细胞中miR-138-5p的水平显著下降，而KDM6B的水平显著上升（图1D-E）。乳腺癌细胞外泌体增加TPH-1细胞中miR-138-5p的表达但抑制KDM6B的表达，但这种作用被miR-138-5p抑制剂处理废除（图3F-G）。转染miR-138-5p mimic的乳腺癌细胞增加了外泌体miR-138-5p的水平（图3H）。过表达miR-138-5p的乳腺癌细胞外泌体增加了miR-138-5p水平，抑制了THP-1细胞中KDM6B的表达（图3I-J）。总之，这些结果表明，癌细胞分泌的外泌体miR-138-5p被传递到巨噬细胞中，并抑制KDM6B。

图3 癌细胞来源的外泌体miR-138-5p下调KDM6B的表达

4、外泌体miR-138-5p通过抑制KDM6B表达调节巨噬细胞极化

随后，作者研究了在不同培养条件下TPH-1的表达谱。首先，和肿瘤细胞共培养抑制了M1相关基因的表达，IL-6，TNF-α，和IL-1β，但是增加了M2相关基因的表达CD163，Arg-1，IL-10,TGF-β和VEGFA。过表达KDM6B部分抑制了上述表现改变（图4A-B）。流式检测显示乳腺癌细胞和TPH-1的共培养增加了CD163阳性细胞数比例，但是过表达KDM6N可以抑制这种效果（图6C）。类似的，过表达KDM6B抑制了miR-138-5p诱导的M2极化（图4D-F）。与对照组相比，乳腺癌来源的外泌体miR-138-5p降低了M1相关表型，相反，M2标志物增加并伴随着CD163阳性细胞数的增加（图6G-I）。用从乳腺癌细胞中分离出来的外泌体处理THP-1细胞导致了M2极化，抑制miR-138-5p的表达可挽救这种极化（图4J-L）。总之，这些结果表明外泌体miR-138-5p通过抑制KDM6B表达调节巨噬细胞极化。

图4 外泌体miR-138-5p通过抑制KDM6B表达调节巨噬细胞极化

5、KDM6B去甲基化酶活性增加了M1相关基因的表达

抑制KDM6B的组蛋白去甲基化酶活性可抑制其靶基因的转录。因此，使用双荧光素酶实验来分析M1靶基因的启动子活性。KDM6B的过表达特异性地刺激了促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α编码基因的启动子活性（图5A）。相反，沉默KDM6B活性则导致他们的启动子活性抑制，而过表达KDM6B降低了H3K27me3的水平（图5B）。ChIP检测显示，与对照相比，THP-1细胞中KDM6B的过表达或敲除显著增加或减少了KDM6B启动子在不同区域的占用(图5C-D)。与此结果一致，启动子区域H3K27me3的募集会降低或增加当KDM6B过表达或沉默时（图5E-F）。总之，下调KDM6B可提高H3K27me3水平和促炎因子编码基因的转录活性，导致抑制M1极化。

图5 KDM6B去甲基化酶活性增加了M1相关基因的表达

6、外泌体miR-138-5p促进乳腺癌肺转移

极化的巨噬细胞在决定肿瘤细胞的表型中起着重要的作用。因此，探究M2巨噬细胞外泌体miR-138-5p处理是否有助于乳腺癌小鼠异肿瘤模型的肿瘤转移。使用氯膦酸钠清除小鼠巨噬细胞，然后转移使用过表达miR-138-5p的T47D或T47D细胞来源的外泌体处理的Raw264.7细胞。小鼠模型通过尾静脉注射4T1-荧光素酶细胞构建（图6A）。结果显示，外泌体miR-138-5p处理组显著促进小鼠体内乳腺癌细胞的肿瘤体积和肺转移，同时增加了CD206和Arg-1阳性细胞数（图6B-E）。这些结果表明外泌体miR-138-5p诱导的M2巨噬细胞促进乳腺癌的肺转移。

图6 外泌体miR-138-5p促进乳腺癌肺转移

参考文献：

Xun Jing., Du Lingfang., Gao Ruifang., Shen Long., Wang Dekun., Kang Lichun., Chen Chuan'ai., Zhang Zhujun., Zhang Yuying., Yue Shijing., Feng Shuxin., Xiang Rong., Mi Xue., Tan Xiaoyue.(2021). Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics, 11(14), 6847-6859. doi:10.7150/thno.51864