piRNA-30473通过调控DLBCL中m6A RNA甲基化而促进肿瘤发生和不良预后
弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是最常见的淋巴恶性肿瘤亚型，它的开始和进展受遗传和表观遗传的畸变控制。N6-甲基腺苷(m6A)作为最丰富的真核信息RNA修饰，通过调控靶基因影响多种基础生物过程；然而，m6A修饰在DLBCL中的作用尚不清楚。此外，piwi相互作用RNA (piRNAs)已被证明是癌症的表观遗传效应。目前，有研究发现piRNA-30473通过调控DLBCL中m6A RNA甲基化而促进肿瘤发生和不良预后，该研究于2021年3月发表在《Blood》杂志，IF为17.543。
技术路线：
1. piRNA-30473在DLBCL中升高，是DLBCL患者的不良预后因素
作者首先研究小RNA的表达水平与DLBCL患者的临床相关性。通过分析微阵列数据，与预后不良组(PP)比较，在预后良好(FPP)的病例中发现了4个显著下调或上调的piRNAs(图1A)。在这四个差异表达RNA的基础上，作者进一步发现与预后良好(FPP)的患者相比，预后不良患者(PP)的piRNA-30473表达水平显著升高(图1B)，且DLBCL患者高水平的piRNA-30473与较差的总生存率相关(图1C)。综上所述， piRNA-30473可作为预后的生物标志物，并可用于DLBCL患者的预后分层。
图1 piRNA-30473在DLBCL中升高，是DLBCL患者的不良预后因素
为了进一步探索piRNA-30473在DLBCL中的功能作用，作者使用antiagomir-30473在DLBCL细胞中去除piRNA-30473。结果发现，与对照组相比，在DLBCL细胞中耗尽piRNA-30473导致增殖减少(图2A)。此外，细胞周期分析显示，在DLBCL细胞中抑制piRNA-30473可以增加G1期细胞的比例，减少S期和G2期细胞的比例(图2B, 2C)。然而，耗尽piRNA-30473并不诱导细胞凋亡(图2D)。此外，通过SU-DHL-8异种移植DLBCL模型，以评估piRNA-30473对体内DLBCL进展的影响(图2E)。结果发现，抑制piRNA-30473抑制肿瘤增长 (图2F)。这些数据表明沉默piRNA-30473可以抑制DLBCL细胞在体内和体外的活性。
图2 抑制piRNA-30473可降低DLBCL的发生
3. piRNA-30473通过调控WTAP的表达介导m6A的甲基化
为了进一步探讨piRNA-30473在DLBCL中转录组调控中的作用，我们在转染antiagomir-30473后48 h检测m6A整体甲基化水平。结果显示，转染antiagomir-30473的细胞总体m6A水平降低(图3A, 3B)。METTL3, METTL14, WTAP, FTO 和ALKBH5是关键的m6A甲基转移酶或去甲基化酶，它们的失调可能导致DLBCL中m6A修饰谱异常。结果发现，抑制piRNA-30473降低了WTAP的表达(图3C,3D)，而其他蛋白表达无明显差异。同时，免疫共沉淀表明，antiagomir-30473处理降低了WTAP与METTTL3和METTTL14的相关性(图3E)。
接下来为了证明piRNA-30473在WTAP mRNA中是否存在结合位点，作者先使用miRNA特异性靶检测算法确定假定的结合位点(图3F)，后续实验结果证明，piRNA-30473通过与WTAP的3’-UTR结合，降低了WTAP mRNA的衰减，进而增强了mRNA的稳定性(图3G,3H)。
图3 piRNA-30473通过调控WTAP的表达介导m6A的甲基化
4. WTAP是DLBCL中piRNA-30473的一个功能重要的靶基因
作者研究WTAP是否在DLBCL的临床结果中发挥了关键作用，并使用免疫组化分析来评估DLBCL患者样本中WTAP蛋白的表达。免疫组化和GEO数据库分析均显示WTAP表达升高预示DLBCL患者预后不良(图4A,4B)。另外耗尽WTAP也可诱导生长抑制和细胞周期阻滞，且无凋亡迹象(图4C, 4D, 4E,图4F)。通过过表达WTAP可在很大程度上挽救对piRNA-30473的抑制作用。这些数据表明WTAP是piRNA-30473的重要功能靶点，并在DLBCL中发挥致癌作用。
图4 WTAP是DLBCL中piRNA-30473的一个功能重要的靶基因
5. 利用高通量RNA-seq和m6A-seq鉴定WTAP靶基因
为了进一步验证WTAP介导的m6A甲基化对DLBCL细胞的影响，对对照组和WTAP缺失的SU-DHL-8细胞进行m6A测序(m6A-seq)。结果发现，一致motif DRACH在免疫纯化的RNA中富集(图5A)，m6A位点主要存在于外显子和3’-UTR中，且m6A位点在终止密码子附近富集程度最高(图5B)，并通过筛选差异表达基因中出现的m6A低甲基化峰，鉴定出136个基因(图5C)。
HK2基因有助于肿瘤高糖酵解率，同时DLBCL在缺氧胁迫下促进生长需要HK2。GSEA分析表明，WTAP的潜在靶基因与缺氧信号显著相关 (图5D)，提示HK2是DLBCL中WTAP的关键靶基因。m6A-seq数据显示，WTAP靶向HK2转录本的5’-UTR, WTAP的敲除导致5’-UTR的m6A水平显著下降(图5E)。最后作者为了验证HK2是否是WTAP靶基因，通过构建荧光素酶报告载体和CRISPR/CAS9敲除实验，证明了HK2是WTAP在DLBCL中的直接下游靶点(图5F,5G,5H,5I,5J)。
图5 利用高通量RNA-seq和m6A-seq鉴定WTAP靶基因
6. WTAP介导的HK2调控依赖于其m6A甲基化酶活性
m6A阅读器IGF2BP2识别WTAP转录本中的m6A位点，以促进其稳定性。qPCR结果显示，IGF2BP2缺陷细胞中HK2的转录水平显著降低(图6A)，mRNA稳定性实验显示HK2在IGF2BP2缺陷细胞中趋于不稳定(图6B)。pGL3-HK2-WT载体的荧光素酶活性通过抑制IGF2BP2而降低，而pGL3-HK2-MUT载体的荧光素酶活性则消失(图6C)。因此， IGF2BP2与WTAP共同作用，影响DLBCL细胞中HK2 mRNA的稳定性和表达。此外，考虑到piRNA-30473在肿瘤发生和疾病进展中的功能重要性，利用选择性抑制剂靶向piRNA-30473/WTAP/HK2轴可能是治疗DLBCL的一种有前景的治疗策略(图6D)。
图6 WTAP介导的HK2调控依赖于其m6A甲基化酶活性
结论：
作者证明了piRNA-30473通过调节m6A RNA甲基化，从而触发下游信号级联而促进DLBCL的肿瘤发生和不良预后。该研究强调了m6A修饰机制在DLBCL中的功能重要性，并通过揭示一个之前未被发现的DLBCL基因调控机制，为肿瘤发生的表观遗传机制提供了深刻的见解。
参考文献：
Han H, Fan G, Song S, Jiang Y, Qian C, Zhang W, Su Q, Xue X, Zhuang W, Li B. piRNA-30473 contributes to tumorigenesis and poor prognosis by regulating m6A RNA methylation in DLBCL. Blood. 2021, 137(12):1603-1614.