circINPP4B调节自身免疫性脑脊髓炎的Th17细胞分化

CircRNAs调节基因表达，参与多种生物学和病理过程。然而，关于特定circRNA对T辅助细胞17 (Th17)分化和相关自身免疫性疾病，如多发性硬化症(MS)的影响知之甚少。本文使用转录组微阵列分析实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的不同阶段，确定了与EAE进展相关的circINPP4B，该circINPP4B在EAE小鼠Th17细胞和Th17体外分化过程中表达上调。该文于2021年8月发表于《Cellular Molecular Immunology》IF:11.53杂志上。

技术路线：

主要实验结果：

1、通过芯片分析鉴定与EAE相关的circRNA

作者构建了EAE小鼠模型，通过EAE的临床特征得分分为4组，如图1A所示，EAE的染色表现为脊髓炎症浸润和脱髓鞘加重。取不同鉴定分数(0、1、2、3、4)的EAE小鼠外周血CD4+淋巴细胞进行芯片检测，获得差异表达的circRNA，其中circRNA-3998在EAE得分高的组中高表达，提示可能与EAE进展有关。

图1 通过微阵列分析鉴定EAE相关的circRNA

2、在CD4+T细胞中circINPP4B的特征

如图2所示，circRNA-3998定位于8号染色体，包含6个外显子，来源于INPP4B基因，长684bp，其反向剪切位点位于外显子8和外显子3之间，并通过随机引物和oligo (dT)18引物证实其环状特性。将其命名为circINPP4B。

图2 在CD4+T细胞中circINPP4B的特征

3、CircINPP4B与Th17细胞体外分化有关

为了探究circINPP4B的表达水平和在EAE进展中的特异性，作者检测了来源于0-4分EAE小鼠的CD4+T细胞中的表达，结果显示随着EAE的加重，circINPP4B在CD4+T细胞中的表达逐渐升高（图3A）。并且与在CD4+ Tn细胞中相比，circINPP4B在CD4⁺ IL-17⁺ T细胞中表达升高明显，在CD4+IFN-γ+ T细胞和CD4⁺CXCR5⁺ T细胞中表达稍微增长（图3B）。于是进一步探究circINPP4B在CD4⁺ IL-17⁺ T细胞中的作用。作者在体外诱导CD4+ Tn细胞分化为Th17细胞，并发现circINPP4B的表达随着诱导天数逐渐增加（图3C）。FISH实验结果表明circINPP4B在Rorγt⁺Th17细胞中显著高表达（图3D）。之后作者发现，敲除circINPP4B后，导致分化为Th17细胞的比例显著下降同时也降低了Th17细胞相关细胞因子的分泌水平（图3E-I）。以上结果表明circINPP4B与Th17细胞体外分化有关。

图3 CircINPP4B与Th17细胞体外分化有关

 
4、沉默circINPP4B可缓解体内EAE

基于以上circINPP4B高表达与EAE进展有关的事实，构建CD4+淋巴细胞circINPP4B敲除的小鼠模型。MOG_35-55免疫后，circINPP4B沉默小鼠出现EAE缓解，发病延迟，EAE峰值评分降低（图4A-B）。HE和LFB染色表明circINPP4B沉默小鼠的脊髓切片的炎症浸润和脱髓鞘更低，此外其MBP蛋白水平增加，并具有更多有髓鞘的轴突和更厚的髓鞘（图4C）。此外，与对照鼠相比，circINPP4B沉默小鼠的外周血，脊髓和淋巴结中IL-17+淋巴细胞组分更低，Th17相关细胞因子水平更少（图4D-F）。

为了进一步证实circINPP4B在体内诱导Th17细胞分化的作用，将circINPP4B沉默的CD4+ Tn细胞转至年龄匹配的Rag1^−/−免疫缺陷小鼠中，然后进行EAE诱导。尽管实验小鼠和对照小鼠的CD4+细胞数量无差别，但是接受circINPP4B沉默的CD4+ Tn细胞转移的Rag1^−/−小鼠的EAE得分更低，且IL-17+淋巴细胞组分更低，而IFN-γ+淋巴细胞没有差异。这些表明沉默circINPP4B可能抑制Th17细胞分化，进而缓解EAE。

图4 沉默circINPP4B可缓解体内EAE

5、CircINPP4B作为miR-30a的海绵

为了鉴定与circINPP4B相互作用的miRNA，对不同得分EAE小鼠来源的外周血CD4+淋巴细胞进行miRNA微阵列分析，获得差异表达的miRNA，根据circINPP4B的表达趋势，作者关注于在EAE得分增加的小鼠中下调表达的9个miRNA，并构建了网络图哦，其中circINPP4B与miR-30a的相互作用强烈（图5A-C）。此外，在Th17细胞分化过程中，circINPP4B的表达逐渐增加，而miR-30a的表达逐渐下降，且敲除circINPP4B后miR-30a的表达显著增加，FISH结果显示circINPP4B和miR-30a具有明显的共定位，RIP的结果表明circINPP4B和miR-30a都在AGO2抗体中显著富集，且circINPP4B探针可以显著下拉miR-30a序列；最后，双荧光素酶实验结果显示miR-30a可以显著下调野生型circINPP4B的荧光素酶活性，但对circINPP4B突变体没有影响。总之，以上结果表明circINPP4B可海绵吸附miR-30a。

图5 CircINPP4B作为miR-30a的海绵

6、CircINPP4B通过miR-30a调控Th17细胞分化

作者之前的研究表明miR-30a可在体内外抑制Th17细胞分化通过靶向IL-21R。因此，这里作者评估了circINPP4B/miR-30a轴对Th17细胞分化的影响。挽救实验的结果显示，在Th17诱导过程中，miR-30a抑制Th17形成，但是circINPP4B通过增加IL-17+的比例和Th17相关细胞因子的分泌以及Rorγt和IL-21R促进Th17的分化（图6A-D）。此外，circINPP4可以部分反转miR-30a的抑制作用，即与过表达miR-30a组比较，共过表达circINPP4B和miR-30a组显著增加了Th17细胞分化。鉴于图3I显示沉默circINPP4B后IL-21的水平显著下降，因此为了确定IL-21下调是否是导致Th17细胞分化抑制的原因之一，作者在培养基中加入了外源性IL-21，结果显示当circINPP4B敲除时外源IL-21不能增加Th17的比例，因此，与IL-21无关。总之，以上结果表明circINPP4B通过阻碍miR-30a对IL-21R的抑制作用促进Th17分化。

图6 CircINPP4B通过miR-30a调控Th17细胞分化

综上所述，如图7，本研究使用转录组芯片筛选了EAE不同阶段小鼠中差异表达的circRNAs，并鉴定出circINPP4B，它可以通过海绵吸附miR-30a调控Th17的分化和EAE的发展。

图7 circINPP4B/miR-30a/IL-21R轴在EAE进展中调控Th17细胞分化的原理模型。miR-30a是Th17分化中的负调控因子，其表达被circINPP4B吸收。红星表示作者之前的结果。红色问号代表了本研究的研究重点。

参考文献：

Han Jingjing., Zhuang Wei., Feng Wanhua., Dong Fuxing., Hua Fang., Yao Ruiqin., Qu Xuebin.(2021). The circular RNA circINPP4B acts as a sponge of miR-30a to regulate Th17 cell differentiation during progression of experimental autoimmune encephalomyelitis. Cell Mol Immunol, undefined(undefined), undefined. doi:10.1038/s41423-021-00748-y