心脏的护花使者——lncRNA LncHrt维持心脏代谢稳态和功能

代谢调节是预防缺血性心脏不良重构的一种有前途的治疗方法。但对lncRNA在调节心脏代谢中的作用知之甚少，本文在心肌梗死(MI)小鼠模型中使用无偏转录组分析lncRNA表达谱，发现了一种新的心肌细胞丰富的lncRNA，称为LncHrt，它可以调节导致心力衰竭的代谢和病理生理过程。总之，本文确定LncHrt是一种心脏代谢调节剂，通过调节下游代谢信号通路在维持心脏功能方面发挥重要作用。本文于2021年8月发表在《Basic Research in Cardiology》IF：17.165期刊上。

技术路线：

主要结果：

1、LncHrt是心肌梗死后下调的心肌细胞富集的lncRNA

为了探索心脏疾病中调控病理生理过程的关键lncRNA，对心肌梗死(MI)后3和14天的小鼠心脏进行微阵列的转录组分析，以sham操作的小鼠做对照组，获得3天和14天的差异表达lncRNA，并验证了5个在实验组最显著下调的lncRNA的表达（图1a-e）。 同时，作者在不同组织中检测了这5个lncRNA的表达，结果发现AK034241和XR_373578是特异性显著富集于心脏组织，并且AK034241是心脏组织中5个lncRNA里最显著的（图1f-h）。因此，作者关注于AK034241并将其命名为lncRNA-heart（LncHrt）。

随后作者探究了LncHrt在小鼠从出生到成年的心脏组织中的表达模式，结果发现在出乎后第7天表达显著升高，随后急剧增加，表明它可能是成年心脏内稳态所需要的，此外，LncHrt同时平均分布在细胞质和细胞核中的，其编码蛋白的可能性非常低（图1i-k）。人LncHrt的基因组位点是保守的，而LncHrt序列在多个物种中在外显子1以及外显子2的5ʹ端和3ʹ端高度保守（图1l）。扩张型心肌病患者LncHrt的人同源物的表达也减少（图1m-n）。以上表明LncHrt可能在调节心脏疾病中发挥重要作用。

图1 LncHrt是心肌梗死后下调的心肌细胞富集的lncRNA

2、敲除LncHrt损伤心脏内稳态

为了探究LncHrt的功能，实验AAV9-shRNA敲除新生儿小鼠中的LncHrt，即AAV-LncHrt KD。结果表明敲除LncHrt后，导致心脏扩大，心脏重量与体重之比提高（HW/BW），而不影响体重（图2a-e）。心电图显示LncHrt敲除后小鼠左心室收缩功能受损，缩短分数下降，明显的左心室扩张和左心室后壁厚度减少（2f-i）。并且这些变化得到了心脏组织学和组织纤维化的结果的支持。与此相反，过表达LncHrt后对小鼠的心脏的影响与上述结果完全相反（图3）。总之，以上结果表明敲除LncHrt损伤心脏内稳态，过表达LncHrt可保护心脏免受心肌梗死。

图2 敲除LncHrt损伤心脏内稳态

图3 AAV9传递的LncHrt过表达可保护心脏免受心肌梗死

3、心肌LncHrt过表达挽救心肌梗死的转录组

为了探究LncHrt的分子机制，作者对LncHrt过表达的MI发生7天后的心脏组织和对照组进行了基因组RNA测序，鉴定差异表达基因（DEGs）。KEGG分析显示这些上调的DEGs主要富集到代谢相关通路，如代谢通路、碳代谢、氧化磷酸化、TCA循环、糖酵解、脂肪酸代谢等，下调的DEGs则显著富集于心脏病理通路，如ECM-受体相互作用和焦点粘连。GO分析也表明上调DEGs显著富集于代谢过程和心脏肌肉组分，下调DEGs则富集在免疫系统过程和炎症响应等（图4a-e），表明LncHrt过表达可能通过介导心脏代谢途径改善MI发生后的心功能。为了验证这一假设，对LncHrt过表达的MI发生7天后的心脏组织和对照组进行比较转录组分析，得出了与上述研究类似的结果（图4f-h）。总之，这些结果表明心肌LncHrt过表达挽救心肌梗死的转录组通过心脏代谢途径。

图4心肌LncHrt过表达挽救心肌梗死的转录组

4、LncHrt改善心肌梗死后心脏代谢稳态

通过RNA-seq分析发现LncHrt在MI后调控代谢过程，因而作者思考LncHrt如何在心脏重构和应激反应中缓解心脏代谢应激，改善代谢表型（图5a）。研究发现，LncHrt敲除导致线粒体的氧通路增强，脂肪酸氧化显著提高，氧化磷酸化增加，呼吸作用复合体增加（图5b-f）。这些研究表明心脏LncHrt过表达改善心肌梗死后心脏氧化磷酸化代谢能力。此外，考虑到MI后氧气供应减少，葡萄糖利用代谢转变，作者检测了葡萄糖关键酶蛋白HK1，PGK1，和能量代谢酶CS，IDH2的表达。结果显示，他们的表达在LncHrt过表达后显著上调（图5g-h）。此外，LncHrt过表达也显著增加了ATP水平（图5i）。而敲除LncHrt则导致线粒体氧代谢的指标显著下降（图5j-m）。总之，这些结果表明LncHrt能保持心肌代谢稳态，改善心肌梗死后的心功能。

图5 LncHrt改善心肌梗死后心脏代谢稳态

5、LncHrt通过与SIRT2相互作用激活LKB1-AMPK信号通路

为了阐明LncHrt在MI反应中调节心肌代谢稳态的分子机制，首先探究LncHrt是否可能调节其邻近基因Klhl33的表达，但是过表达LncHrt对其体内外的表达没有影响，于是作者探究了其相互作用的蛋白。质谱和pull-down联合分析初步锁定了LncHrt与SIRT2的相互作用关系（图6a-c）。反过来，LncHrt也在SIRT2的免疫磁珠中显著富集（图6d-e）。表明LncHrt与SIRT2的相互作用。

然后研究这种相互作用的功能相关性。先前的研究表明，SIRT2使下游激酶LKB1去乙酰化，促进LKB1的磷酸化，随后激活LKB1-AMPK信号通路。这一途径通过保存肥大心脏中AMPK的活性来保护心脏。研究发现LncHrt过表达促进LKB1磷酸化，从而导致下游的激酶AMPK在Thr172位点磷酸化（图6f-g），相反LncHrt敲除减少LKB1和AMPK的磷酸化抑制LKB1-AMPK信号（与6h-i）。这些数据是由基因集富集分析LncHrt过表达的心脏RNA-seq数据支持，LKB1-AMPK通路对mTOR的能量依赖性调节被富集(图6j)。综上所述，这些研究表明LncHrt与SIRT2相互作用，通过调节梗死心脏中LKB1-AMPK信号通路来调节其功能。

图6 LncHrt通过与SIRT2相互作用激活LKB1-AMPK信号通路

6、LncHrt通过阻断CDK5对SIRT2的抑制来维持SIRT2活性

由于LncHrt保留了SIRT2的活性并促进了下游激酶的活性，进一步探究LncHrt如何影响SIRT2上游信号以正向调节其活性。研究发现LncHrt不影响Sirt2转录水平或蛋白表达，因为在LncHrt功能获得或功能丧失模型中中Sirt2没有改变（图7a-e）。鉴于此前一项研究揭示p35-Cdk5在有丝分裂后细胞中通过S331磷酸化抑制SIRT2催化活性的翻译后机制。作者推测CDK5转录后调节SIRT2，并抑制了LKB1-AMPK活性。作者发现LncHrt下调促进了CDK5和SIRT2之间的相互作用，随后，提高了LKB1的赖氨酸乙酰化，导致LKB1活性及其下游信号级联的破坏（图7f-i）。这一观察结果排除了LncHrt直接调节CDK5表达的想法。

最后，探究CDK5耗尽是否会调节心肌细胞中LKB1-AMPK信号下游的SIRT2。结果发现敲除CDK5会提高LKB1-AMPK信号，但是SIRT2抑制显著阻断了LKB1-AMPK信号的激活（图7j-k）。因此， CDK5通过调节SIRT2活性介导LKB1-AMPK信号通路。LncHrt表现出心脏代谢保护，至少部分是通过干扰SIRT2的催化活性，导致LKB1-AMPK信号激活。

图7 LncHrt通过阻断CDK5对SIRT2的抑制来维持SIRT2活性

7、LncHrt对梗死心脏的治疗潜力

在证明LncHrt可以保护心脏免受心肌梗死损伤后，接下来探讨LncHrt是否可以作为治疗梗死心脏的潜在治疗靶点。MI后向心肌内注射AAV9-LncHrt或AAV9-CTRL，并持续监测LncHrt的表达，直至其在两组间表现出显著差异。结果发现，LncHrt敲除后改善了心脏的形态，显著降低了HW/BW比值（图8a-b）。注射2周后，LncHrt敲除改善了心脏功能，表现为缩短分数增加，心室内经减小（图8c-e）。组织学也表明LncHrt敲除后心脏组织的病理性变化显著减少（图8f-j）。此外，敲除LncHrt后心脏代谢内稳态也得到恢复，表现在氧通量，呼吸作用和ATP等（图8k-o）。总之，这些表明LncHrt对梗死心脏的有治疗潜力。

图8 LncHrt对梗死心脏的治疗潜力

本文鉴定了一种名为LncHrt的新型心肌细胞富集的lncRNA，它作为心脏代谢的重要调节因子发挥作用。LncHrt是MI反应中下调最多的lncRNA，对心脏稳态至关重要，因为LncHrt的耗竭会损害心脏形态、代谢和功能。重要的是，心脏特异性过表达LncHrt通过表达参与代谢信号和肌肉收缩的基因保护MI后的心脏。LncHrt过表达，心脏中转录组的改变补偿了MI诱导的代谢信号的失调。此外，lncRNA与代谢偶联的机制是通过SIRT2-LKB1-AMPK轴介导的，这为lncRNA可以影响代谢信号级联提供了证据（图9）。总之，该研究确定LncHrt是一种新型的心脏lncRNA，并揭示了lncRNA在病理应激后维持心脏代谢稳态中未被认识的作用。

图9 LncHrt在心肌梗死中的作用机制的工作模型

参考文献：

Liu Ning., Kataoka Masaharu., Wang Yingchao., Pu Linbin., Dong Xiaoxuan., Fu Xuyang., Zhang Feng., Gao Feng., Liang Tian., Pei Jianqiu., Xiao Changchen., Qiu Qiongzi., Hong Tingting., Chen Qiming., Zhao Jing., Zhu Lianlian., He Junhua., Hu Xiaoyun., Nie Yu., Zhu Wei., Yu Hong., Cowan Douglas B., Hu Xinyang., Wang Jian'an., Wang Da-Zhi., Chen Jinghai.(2021). LncRNA LncHrt preserves cardiac metabolic homeostasis and heart function by modulating the LKB1-AMPK signaling pathway. Basic Res Cardiol, 116(1), 48. doi:10.1007/s00395-021-00887-3