circPLCE1编码的NF-κB调控因子抑制结直肠癌进展
NF-κB信号的组成性激活在结直肠癌(CRC)的发生发展中起着关键作用。然而，NF-κB信号通路过度激活的潜在机制在很大程度上尚不清楚。circPLCE1编码的一种新蛋白circPLCE1-411被鉴定为NF-κB激活的关键蛋白。机制上，circPLCE1-411通过直接结合HSP90α/RPS3复合物促进RPS3从复合物中分离，促进了关键NF-κB调节因子RPS3的泛素依赖性降解，从而减少了CRC细胞中NF-κB核转位。在功能上，circPLCE1抑制CRC细胞中的肿瘤增殖和转移，以及患者来源的异种移植瘤和原位异种移植瘤模型。临床上，circPLCE1在CRC组织中下调，并与晚期临床阶段和低生存率相关。本文于2021年8月发表在Molecular Cancer（IF=27.401）期刊上。
技术路线
结果：
1）CRC中circPLCE1的特征及临床意义
为了识别CRC中差异表达的circRNA，我们使用正常的人类肠道上皮细胞系和CRC细胞系进行了总RNA测序。我们确定研究对象为circPLCE1 (hsa_circ_0019223，命名为circPLCE1)。我们分析了85对CRC样本中的circPLCE1表达，证实了88.2%(75/85)的CRC患者中circPLCE1表达下调(图1A和B)。进一步分析显示，circPLCE1在晚期临床期或T期患者中表达下调(图1C和D)。使用qRT-PCR分析circPLCE1在正常人肠上皮细胞株和CRC细胞株中的表达水平差异，得到了相似的结果(图1E)。circPLCE1由PLCE1外显子2反向剪接而成。通过Sanger测序证实了circPLCE1的反向拼接连接(图1F)。PLCE1的环状转录本只能通过扩增引物在cDNA中扩增(图1G)。circPLCE1还能抵抗RNase R酶切(图1G和H)。半衰期试验进一步表明，circPLCE1比circPLCE1线性mRNA更稳定(图1I)。通过核质量分离试验和荧光原位杂交(FISH)检测了circPLCE1的定位，结果显示circPLCE1在CRC细胞的细胞质中富集(图1J和K)。此外，circPLCE1在临床晚期或T期患者中表达较低(图1L)。Kaplan Meier曲线结果显示，CRC患者circPLCE1表达较低与较差的生存率相关(图1M)。这些数据验证了circPLCE1的特征和临床意义。
2）circPLCE1体外抑制CRC细胞增殖和迁移
为了阐明circPLCE1在CRC中的功能，我们构建了稳定过表达circPLCE1的CRC细胞系。circPLCE1过表达抑制了CRC细胞集落形成、球体形成和不依赖于锚定的生长(图2A-C)。此外，我们在两个患者来源的器官(PDOs)中过表达了circPLCE1，结果也表明，circPLCE1降低了PDOs的生长(图2D)。过表达circPLCE1也抑制细胞迁移和侵袭(图2E和F)。此外，circPLCE1敲低显著促进了CRC细胞的生长、迁移和侵袭(图2G-K)。综上所述，circPLCE1在CRC细胞的增殖和迁移中发挥重要作用。
3）circPLCE1编码一种新的蛋白circPLCE1–411
为了研究CRC中circPLCE1的详细机制，我们首先使用编码潜能评估工具分析了circPLCE1的编码潜能，提示circPLCE1的蛋白编码概率大于0.999。接下来，我们分析了circPLCE1的ORF。在circPLCE1中存在一个潜在的跨越连接ORF编码一个411氨基酸蛋白(以下简称circPLCE1-411，图3A)。通过双荧光素酶分析验证了驱动ORF翻译的内部核糖体进入位点的活性(图3B)。接下来，我们构建了flag标记的质粒以确定circPLCE1-411的存在。通过qRT-PCR检测circPLCE1和线性PLCE1的表达(图3C)。此外，我们发现PLCE1抗体在circPLCE1-411中具有相同的免疫原序列(图3D)。Western blot结果显示，在不影响PLCE1表达的情况下，PLCE1和flag抗体可在50 kDa左右检测到circPLCE1-411 (图3E)。此外，qRT-PCR和western blot检测表明，circPLCE1或circPLCE1-411并不影响PLCE1的含量(图3C和E)。为了鉴定该蛋白，我们用转染了flag标记的circPLCE1载体的细胞裂解液进行免疫沉淀分析(图3F和G)。结果证明circPLCE1编码了这种新蛋白(图3H)。为了探索circPLCE1-411的潜在临床意义，我们通过western blot分析了CRC样本和正常邻近组织中circPLCE1-411的表达。结果显示，circPLCE1-411在大多数CRC组织中下调(图3I)。此外，circPLCE1-411表达与肿瘤的临床分期和T分期呈负相关(图3J和K)。
4）circPLCE1通过编码circPLCE1-411抑制CRC细胞增殖和迁移
为了探索circPLCE1-411的生物学功能，我们进行了细胞实验。结果表明，转染circPLCE1或circPLCE1-411的CRC细胞可抑制集落形成、球的形成、不依赖于锚定的生长和PDOs生长。然而，用带有起始密码子突变体的circPLCE1载体(circPLCE1-ATGmut)转染对CRC细胞增殖没有影响(图4A-H)。此外，细胞迁移和伤口愈合实验也显示，转染circPLCE1或circPLCE1-411载体可抑制CRC细胞迁移和侵袭，而转染circPLCE1-ATGmut对CRC细胞迁移没有影响(图4I-L)。这些数据表明，circPLCE1通过编码circPLCE1-411而不是circPLCE1的circRNA形式来抑制CRC细胞的增殖和迁移。
5）circPLCE1 - 411与HSP90α/RPS3复合物结合，促进泛素依赖的RPS3降解，抑制NF - κB信号通路
根据前期研究和相关文献我们推测circPLCE1-411可能与HSP90α/RPS3复合物结合，调控NF-κB信号通路，从而抑制CRC的进展。我们在HCT8和DLD1细胞中通过免疫沉淀鉴定了circPLCE1-411和HSP90α/RPS3复合物之间的相互作用(图5A)。我们发现RPS3蛋白水平随着circPLCE1-411表达的增加而显著降低(图5B，上)。然而，RPS3 mRNA水平的丰度并没有随着circPLCE1-411表达的增加而改变(图5B，底部)。这提示circPLCE1-411可能通过转录后机制调控RPS3。经蛋白合成抑制剂环己亚胺CHX处理后，与对照组相比，HCT8和DLD1细胞中RPS3蛋白降解更快，circPLCE1-411表达增加(图5C)。此蛋白酶体抑制剂MG132的作用减弱了circPLCE1-411对RPS3蛋白水平的影响(图5D)。circPLCE1过表达的细胞中RPS3泛素化水平升高。相反，circPLCE1敲低后，RPS3的泛素化水平降低(图5E)。接下来，我们用相同浓度的HA-HSP90α、HisRPS3和Myc-HSP70质粒转染HEK293T细胞，但增加Flag-circPLCE1质粒的浓度用于后续的免疫沉淀实验。结果表明，随着circPLCE1-411表达量的增加，RPS3与HSP90α的互作性降低，而与HSP70的互作性增加(图5F)。为了鉴定HSP90α与RPS3和circPLCE1-411相互作用的结构域，我们生成了HSP90α截断突变体，发现RPS3和circPLCE1-411的相互作用依赖于HSP90α的N端(图5G)。
由于RPS3是NF-κB的重要调控因子，我们进一步分析了circPLCE1对NF-κB信号通路的影响。Western blot结果显示，过表达circPLCE1-411导致全细胞提取物中p-P65表达降低，细胞核中P65表达下调。正如预期的那样，核P65的DNA结合活性也减弱了。相反，circPLCE1-411敲低则上调了全细胞提取物中p-P65的蛋白水平，增加了细胞核中P65的积累，增强了细胞核中P65的DNA结合活性(图5H-I)。综上所述，circPLCE1-411结合HSP90α的N端，促进RPS3与HSP90α/RPS3复合物的解离，导致RPS3的泛素依赖性降解，抑制NF-κB信号。
为了证实circPLCE1-411在体内的功能，我们建立了原位异种移植瘤模型，观察肿瘤生长和肝转移情况。我们的结果显示，载体组和circPLCE-ATGmut组均出现80%(4/5)的结直肠肿瘤形成，60%(3/5)和40%(2/5)的肝转移。在circPLCE1和circPLCE1-411组中，5只小鼠中有2只(40%)形成了肿瘤较小的原位肿瘤，未发现肝转移(图6A-C)。此外，我们分析了人HPRT mRNA在肝脏中的表达，证实circPLCE1-411诱导肝转移瘤负荷显著增加(图6D)。为了进一步探索这些作用，我们应用了PDX模型来评估circPLCE1-411通过肿瘤内慢病毒注射的潜在疗效。结果显示，与载体和circPLCE-ATGmut慢病毒处理的肿瘤相比，circPLCE1或circPLCE1-411慢病毒处理的肿瘤导致肿瘤生长明显放缓(图6E和F)。此外，我们分离了PDX肿瘤，并通过H&E、ISH和IHC染色评估它们。并发现circPLCE1和circPLCE-ATGmut组的circPLCE1表达上调。circPLCE1或circPLCE1-411组中RPS3和p-P65的表达降低(图6G和H)。综合这些结果，我们确定了circPLCE1-411在体内CRC肿瘤生长和转移中的关键作用。
结论：circPLCE1编码的circPLCE1-411可与HSP90α/RPS3复合物结合，促进关键的NF-κB调控因子RPS3从复合物中解离，从而促进其泛素依赖性降解，最终导致NF-κB核易位减少。此外，circPLCE1表现出一种破坏NF-κB核易位的表观遗传机制，可作为一种新的、有前景的治疗靶点和预后标志物。