外泌体传输的miRNA-335-5p通过靶向RASA1促进EMT以促进结直肠癌侵袭和转移
结直肠癌 (CRC) 在世界范围内普遍存在，其死亡率主要是由于其转移到远处的关键器官而造成的。外泌体-microRNA（miRNA）分泌已被表征为癌细胞间细胞间通讯的重要因素。 然而，癌症分泌的 miRNA 与结直肠癌 (CRC) 转移的特异性相关知之甚少。因此了解 CRC 转移的确切分子机制对于确定新的诊断生物标志物和制定 CRC 患者的治疗策略非常重要。目前，有作者对这一机制进行了研究，该研究于2021年6月发表在《Molecular Therapy-Nucleic Acids》，IF：8.886。
技术路线：
研究结果：
1. CRC 细胞外泌体的表征
作者分离从CRC 细胞表面脱落的各种囊泡，通过电子显微镜、纳米颗粒大小电位分析和蛋白质印迹鉴定外泌体（图1A-1C）。为了确定外泌体是否可以被 CRC 细胞内化，用荧光染料 PKH67 标记外泌体，然后将它们与 SW480 细胞共培养，结果显示 SW480 细胞表现出高吸收效率（图1D）。与 PKH67 标记的外泌体孵育 24 小时后，超过 90% 的 SW480 细胞对 PKH67 荧光呈阳性，表明外泌体被 SW480 细胞内化。
图1 来自结直肠癌(CRC)细胞系的外泌体的特性
2. 转移性CRC SW620细胞分泌的外泌体促进CRC细胞的迁移、侵袭和EMT
作者使用细胞系 SW480 和 SW620 作为实验模型，通过CCK-8 在 24 小时、48 小时和 72 小时测定细胞活力。结果表明，SW480-exo 或 SW620-exo 细胞对细胞生长没有显着影响（图 2A）。此外，平板集落形成分析显示 SW480-exo 或 SW620-exo 细胞之间的生长没有差异（图 2B）。然而，来自转移性 CRC SW620 细胞的外泌体通过 Transwell 测定显着促进了 SW480 细胞的迁移和侵袭（图 2C）。此外，与 SW480-exo 和对照组相比，SW620-exo 提高了 SW480 细胞的伤口愈合能力（图 2D）。蛋白质印迹分析以确定与 EMT 相关的蛋白质的表达水平。结果表明，相对于 SW480-exo 处理，SW620-exo 处理显着增加波形蛋白、纤连蛋白和 N-钙粘蛋白的表达并降低 E-钙粘蛋白的表达（图 2E），表明源自转移性 CRC 细胞的外泌体在 SW480 中诱导了 EMT。
图2来自转移性 CRC 细胞系 SW620 的外泌体促进 CRC 细胞迁移、侵袭和上皮间质转化 (EMT)
3. miR-335-5p 在来源于转移性 CRC 细胞的外泌体中高表达
作者进行 miRNA 测序以确定 SW480-exo 或 SW620-exo 中的 miRNA 表达谱。结果发现 SW480-exo 和 SW620-exo 具有显着不同的 miRNA 表达谱（图 3A），并确定了 77 个 miRNA 的倍数变化大于 5（图 3B）。通过定量 PCR，证实 miR-335-5p 在 SW620-exo 中的表达比在 SW480-exo 中更高（图 3C）。并使用来自TCGA数据库的 miRNA 和 mRNA 表达数据，证实了 CRC 中的 miR-335-5p 相对于正常样本显着升高（图 3D），以及 miR-335-5p 高表达的病例的总体存活率较低（图 3E）。为了探索 miR-335-5p 在 CRC 中的功能，作者对 miR-335-5p 高或低表达的 CRC 样本中表达的基因进行了基因集富集分析 (GSEA) 分析。确定了两种生物学途径的显着富集：Ras 蛋白信号转导和 Ras 蛋白信号转导的调节（图 3F 和 3G）。这些结果表明SW620外泌体具有较高水平的miR-335-5p，miR-335-5p在CRC中的功能可能与Ras信号通路的激活有关。
图 3 miR-335-5p 在 SW620-exo 中的表达显着高于 SW80-exo
4. miR-335-5p通过靶向RASA1促进CRC细胞的迁移和侵袭
作者使用TargetScan、miRDB 和 miRTarBase miR-335-5p 三种生物信息学算法预测潜在的靶基因（图 4A）。从 TCGA 下载的数据分析表明，RASA1 的表达与 CRC 患者的 miR-335-5p 水平显着相关（图 4B）。图 4C 显示了通过生物信息学分析确定的 RASA1 3' UTR 中的假定的miR-335-5p 靶位点。 使用野生型 (WT) RASA1 3' UTR 在 SW480 细胞中进行的荧光素酶报告实验，结果表明转染 miR-335-5p 模拟物后荧光素酶活性显着降低（图 4C）。 相比之下，突变 (mut) RASA1 序列的报告基因的荧光素酶活性不受 miR-335-5p 的影响（图 4C），表明 miR-335-5p 直接靶向 RASA1 3' UTR 的特定区域。为了确定 miR-335-5p 对 RASA1 的影响，使用 Lipofectamine 3000 将 miR-335-5p 模拟物瞬时转染到 SW480 和 SW620 细胞中。用定量逆转录酶 PCR (qRT-PCR) 和蛋白质印迹进行评估表明 mRNA RASA1 和蛋白质水平在模拟转染细胞中显着下调（图 4D）。 此外，miR-335-5p 转染增加了 Ras 蛋白的表达（图 4E）。 miR-335-5p 的上调可能伴随着 EMT 激活，如 SW480 和 SW620 细胞中波形蛋白表达增加和 E-钙粘蛋白表达降低所证明的（图 4F）。 此外，miR-335-5p 水平升高显着促进迁移和侵袭，而用 miR-335-5p 抑制剂抑制 miR-335-5p 显着抑制 CRC 细胞的迁移和侵袭（图 4G 和 4H）。
图 4 miR-335-5p 通过靶向 RASA1 抑制 CRC 细胞迁移、侵袭和 EMT
5. 外泌体传递的miRNA-335-5p通过靶向RASA1促进CRC细胞迁移、侵袭、EMT和转移
作者用 miR-335-5p 模拟物或阴性对照 (NC) 转染的 SW480 细胞的条件培养基中收集外泌体。使用 qRT-PCR 检测这些外泌体中 miR-335-5p 的水平。结果显示含有模拟物（miR-335-5p 模拟物-exo）的外泌体显着促进了 SW480 和 SW620 细胞的迁移和侵袭（图 5A 和 5B），并且还降低了 RASA1 蛋白表达并增加了 Ras 蛋白表达（图 5C）。此外，miR-335-5p 模拟物-exo抑制 EMT，如上皮标志物 E-钙粘蛋白的表达降低和间充质标志物波形蛋白的表达增加（图 5D）。最后，用 miR-335-5p 模拟物-exo处理的细胞显示出更强的体内转移促进作用（图 5E 和 5F），肺表面宏观结节的数量急剧增加。这些结果表明，外泌体介导的 miR-335-5p 穿梭可能会加速 CRC 细胞的体外迁移和侵袭以及体内转移，同时伴随着 Ras 信号和 EMT 的激活。
图5 外泌体传递 miRNA-335-5p促进CRC细胞侵袭、转移和EMT，并降低RASA1水平
6. RASA1的上调消除了外泌体miR-335-5p对CRC细胞迁移和侵袭的促进作用
为了进一步确定 RASA1 在 CRC 细胞中的潜在功能，使用慢病毒载体建立了过表达 RASA1 的稳定 SW480 细胞系。 如图 6A 和 6B 所示，在用表达 RASA1 的慢病毒载体（lenti-RASA1；SW480-RASA1）转染的 SW480 细胞中，实时 PCR 和蛋白质印迹验证了 RASA1 mRNA 和蛋白质的过表达。 在过表达 RASA1 的细胞中，Ras 和波形蛋白的蛋白质水平显着下调，而 E-钙粘蛋白上调（图 6C）。 此外，与 SW480 载体对照相比，SW480-RASA1 的迁移和侵袭能力显着降低（图 6D）。
接下来研究 RASA1 是否参与了 CRC 细胞中外泌体 miR-335-5p 对迁移、侵袭和 EMT 的诱导。 蛋白质印迹分析显示，miR-335-5p模拟物-exo增加了Ras和波形蛋白的蛋白水平，但降低了RASA1和E-钙粘蛋白的蛋白水平； 对于 RASA1 过表达，观察到这些蛋白质的反向表达趋势（图 6E）。 此外，RASA1 过表达逆转了 miR-335-5p模拟物-exo诱导的 SW480 细胞迁移和侵袭（图 6F）。 这些结果表明外泌体 miR-335-5p 可能通过靶向 RASA1 诱导迁移、侵袭和 EMT。
图6 RASA1异位表达抑制CRC细胞迁移和侵袭，消除外泌体miR-335-5p对细胞迁移和侵袭的促进作用
结论：
该研究揭示了外泌体 miR-335-5p 在 CRC 转移中的新功能，并阐明了外泌体包裹的 miR-335-5p 通过直接靶向 RASA1 促进 CRC 细胞侵袭、转移和 EMT 转化。 这些发现强烈表明外泌体 miR-335-5p 可能是一种预后生物标志物，并为解决 CRC 转移提供有价值的治疗策略。
参考文献：
Sun X, Lin F, Sun W, Zhu W, Fang D, Luo L, Li S, Zhang W, Jiang L. Exosome-transmitted miRNA-335-5p promotes colorectal cancer invasion and metastasis by facilitating EMT via targeting RASA1. Mol Ther Nucleic Acids. 2021; 24:164-174. doi: 10.1016/j.omtn.2021.02.022