胆固醇稳态失调导致铁死亡抵抗增加肿瘤的致瘤性和转移

高胆固醇血症和血脂异常与许多癌症类型的风险增加和已确诊疾病患者的不良预后相关。然而，这种情况发生的机制是多因素的。证据表明，高胆固醇血症是绝经后妇女患乳腺癌的独立危险因素。作者发现，细胞长期暴露于27-羟基胆固醇(27HC)，一种丰富的循环胆固醇代谢物，会选择性使细胞表现出细胞摄取和/或脂质生物合成增加。这些细胞表现出肿瘤发生和转移的能力。重要的是，积累的脂质对细胞施加的代谢压力需要GPX4的持续表达，这是一种铁死亡的负调节剂。作者发现铁死亡抵抗是转移性细胞的一个特征，并进一步证实GPX4敲除减轻了27HC抵抗细胞的肿瘤生成和转移活性。本文于2021年9月发表在《Nature Communications》IF:14.919。

技术路线

主要实验结果

1、羟甾醇27HC通过抑制胆固醇摄取/合成的能力来减少癌细胞的生长

首先评估了27HC对雌激素受体（ER）阳性MCF7细胞在去除外源性类固醇的培养基(炭剥离培养基(CFS))与完全培养基（FBS）中的生长活性。在这里，使用的27HC的浓度范围是正常个体循环中的~1 µM至高脂血症患者体内的2.5–5 µM。结果发现，在CFS中，雌激素活性的27HC支持了细胞增殖，但是在FBS中，同样浓度的27HC抑制了细胞增殖（Fig 1a）。类似的，27HC在CFS中促进集落形成，在FBS中抑制集落形成（Fig 1b）。但是这些结果在ER阴性细胞完全相反，其27HC抑制了乳腺癌细胞系4T1, MDAMB436, Py230, MDAMB231, HCC1954的增殖（Fig 1c）。在2D培养体系中，雌激素无反应的Met1细胞对27HC的抗增殖活性具有抵抗作用，但是在3D培养的集落形成实验中，27HC有效的抑制了4T1，Met1的集落形成（Fig. 1d）。这些结果表明，不同于ER阳性细胞，在ER阴性细胞中27HC抑制细胞增殖，集落形成和体外迁移。

我们认为27HC对观察到的ER阴性癌细胞生物学的影响可能归因于它作为胆固醇合成/摄取的负调控因子通过对SREBP和LXR依赖的信号通路的作用。事实上，作者发现在受检的肿瘤细胞中，27HC抑制SREBP1c和SREBP2的靶基因的表达，而作为LXR受体激动剂活性也在一些细胞系中观察到（Fig. 1e）。尽管如此，作者不认为27HC的LXR活性对其癌细胞的作用有显著贡献，因为已经证明(a)在探索的细胞中，27HC是LXR相对较弱的部分激动剂，(b) LXR完全激动剂在这些细胞中不复制27HC的抗增殖活性。因此，尽管27HC可以激活LXR并诱导细胞胆固醇外流相关基因的表达，但这种活性不足以抑制癌细胞的增殖。这就表明27HC的主要功能可能是抑制SREBP依赖的脂质/胆固醇摄取和合成。为了支持这一观点，作者证明了补充胆固醇可以逆转27HC的抗增殖活性（Fig. 1d），而甲戊酸和其他胆固醇生物合成的上游中间体无法挽救27HC对癌细胞生长或集落形成的抑制作用（Fig. 1d）。以上表明27HC在细胞中的抗增殖活性主要是抑制胆固醇的合成/摄取。

图1 27HC抑制ER阴性乳腺癌细胞的生长

2、在体内，慢性暴露于27HC可选择更具致瘤性和转移性的细胞

目前已建立的联系是胆固醇升高和癌症进展相关，作者认为，虽然这些临床观察与27HC抑制细胞增殖的结果不一致，这可能与本研究中通过使细胞/肿瘤发生胆固醇/ 27HC急性升高而建立的高胆固醇血症模型有关。为了探索这种可能性，构建27HC抗性版本的4T1、Py230、BPD6、HCC1954、MDAMB436和B16F10细胞，在5μM 27HC持续存在的2D培养中传代14个月，直到菌落出现。4T1、Py230和BPD6的27HC敏感和等基因抗性细胞在2D培养下的时间/剂量-响应生长曲线如Fig. 2a所示。尽管27HC的敏感性存在显著差异，但在不含27HC的情况下，敏感细胞（27HCS）和耐药细胞（27HCR）的总体增殖能力相似。然而，当作为异种移植物在小鼠体内传播时，所有这三种细胞模型的27HC抵抗衍生物都显示出比27HC敏感的衍生物更具有致瘤性(Fig.2b)。尾静脉注射模型评估敏感和耐药细胞的肺转移能力，结果显示，在三种模型(4T1, Py230和BPD6)中，对27HC的抗性与显著增加的转移潜能相关(图2c)。综上所述，细胞在适应27HC水平的增加时，获得了使它们更具致瘤性和转移性的活性。

图2慢性暴露于27HC可选择性增加恶性表型的细胞

3、细胞内脂质积累增加是抗27HC的一个特征，也和致瘤性有因果关系

随后探究27HC抵抗增加致瘤性和转移性的生物化学机制。首先探讨了27HC下调胆固醇/脂类合成的机制可能在抵抗细胞中被破坏的可能性。然而，基因表达分析显示，在基础条件下，编码这些过程的关键调控步骤的mRNA变化不大，而且在敏感和耐药细胞中，27HC仍然是它们表达的有效抑制剂（Fig. 3a）。这表明在27HC抵抗细胞中，27HC对SREBP活性的负反馈保持完整。然而，使用BODIPY染色评估脂质含量时，发现所有27HCR细胞都积累了大量的中性脂质，以细胞质脂滴(LDs)的形式储存（Fig. 3b）。提示为了抵消27HC对胆固醇和脂类合成的抑制作用，27HCR细胞可能增加了它们摄取中性脂质的能力。为了直接解决这一问题，并确认积累的脂质的身份，对HCC1954细胞的27HCR和27HCS衍生物进行了全面的脂质组学分析，发现细胞对27HC抗增殖作用的一个特点是脂质摄取增加和脂质生物合成的减少。

虽然脂质摄取增加和/或生物合成之间的关联被确定为27HC耐药的标志，但这种活性在多大程度上与耐药相关和/或是否有助于癌细胞生物学的变化尚不清楚。为了解决这一问题，作者反复研究了27HCS和27HCR的4T1、Py230、HCC1954、B16F10和BPD6细胞在富脂和脱脂培养基中对27HC的敏感性/耐药性。如Fig. 3c所示，除BPD6细胞外，27HC的抗增殖活性仅在脂质充足的条件下表现出来。鉴于与BPD6-27HCS相比，BPD6-27HCR中涉及胆固醇和脂肪酸生物合成的基因表达上调(见Fig.S4a和Fig.S2)，这些细胞中积累的一些脂质可能是内源性产生的。研究还强调了脂质积累在耐药细胞中的重要性，研究表明脂质消耗逆转了27HCR细胞体外迁移能力的增加（Fig. 3d）。综上所述，这些数据表明，在获得对27HC的抗性时，27HCR细胞增加了它们的脂质摄取，这一活动可能有助于增加它们的恶性表型。

图3脂质摄取增加是细胞抵抗27HC抗增殖作用的一个特征

4、27HC抗性细胞可防止细胞铁死亡

异常的脂质代谢涉及到癌症细胞病理学的多个方面。但是本研究中观察到的27HC细胞中脂质积累也被认为是给细胞带来了代谢压力，而27HC细胞克服了这种脂质过氧化的积累。近来，细胞可以忍受GPX4依赖抗氧化途径和脂质氧化酶下调产生的脂质依赖压力。因此，作者推测在进化到27HC耐药状态的过程中，癌细胞可能会增加诱导铁死亡的阈值。作为这些研究的起点，作者评估了GPX4在几种细胞系(B16F10、Py230、HCC1954和MDAMB436)中的表达。WB表明，GPX4在所有细胞中均有表达，且在27HC浓度增加的情况下，GPX4表达下调（Fig. 4a）。这是一个重要的发现，尽管并非完全出乎意料，因为GPX4合成所需的特殊selenocysteine-tRNA的成熟需要焦磷酸异戊酯（来自甲戊酸途径）。事实上，在细胞补充外源性甲戊酸后，27HC依赖性下调GPX4的表达会显著减弱（Fig. 4b）。此外，在Py230、HCC1954和MDAMB436细胞的27HCR衍生物中，观察到与脂质过氧化增加相关的基因(Acsl4、Lpcat3和Pebp1)的表达下调（Fig. 4c）。综上，调控机制的破坏导致GPX4的下调，以及通过调节与脂质过氧化相关基因的表达来降低GPX4通路的胁迫，是27HCR细胞的一个特征。无论其机制如何，作者推断，如果GPX4的稳定表达和/或活性与27HC抗性表型(ferroptosis)有因果关系，那么27HCR细胞应该对GPX4途径的抑制剂有更强的抗性。如Fig.4d所示，B16F10、Py230、MDAMB436、HCC1954和4T1细胞对GPX4的直接抑制剂(RSL3和ML210)和xc转运体(erastin)的抗性明显增强。这些药物对所有27HCS细胞活力的影响被ferroptosis抑制剂ferrostatin逆转，证实铁死亡确实是这些药物靶向的目标。进一步研究表明GPX4抑制剂(RSL3和ML210)导致27HCS细胞中脂质过氧化物大量增加，但在27HCR细胞系中没有观察到(图4e)。结论是，在适应脂质诱导的代谢应激中，细胞可以通过稳定GPX4的表达，增加GPX4依赖的抗氧化系统的活性，或减少脂质过氧化物的产生来避免铁死亡，进而产生对27HC的抗性。

图4 27HCR细胞对铁死亡有抗性

5、GPX4活性预防铁死亡促进转移

作者推测细胞对铁死亡的抗性可能使细胞能够抗住在转移过程中面临的代谢和环境压力。如Fig. 5a所示，注射Py230-27HCS细胞的小鼠发生micrometastasis，而注射Py230-27HCR细胞的小鼠发生macrometastasis；但是无论是从micrometastasis还是从macrometastasis处分离出的转移病灶表现出相似的对铁死亡诱导剂（RSL3和ML210）相同的抗性（Fig. 5a，右）。因此，27HCR细胞转移表型的增加可能是促进27HC抗性的适应性事件的结果，而不是与羟甾醇治疗相关的基因表达/生化活性的特定变化。

此外，GPX4的敲除显著降低了B16F10细胞27HCS和27HCR衍生物的转移，尽管后者的转移程度较低（Fig. 5b）。同样，通过直接计数转移结节证明，在Py230细胞的27HCR衍生物中观察到的转移表型在GPX4敲低后完全消除（Fig. 5c）。这些数据证实了GPX4在转移过程中预防铁死亡的重要作用。

图5 GPX4抑制可使27HCR细胞对ferroptosis敏感并降低其转移能力

总之，在处理与脂质代谢失调相关的压力时，细胞如何上调GPX4轴的活性和/或减少对GPX4的依赖以适应这种压力，这有增加细胞转移能力的附带责任。急性27HC （Fig.5，左）处理通过干扰SREBPs和LXR信号传导扰乱脂质代谢，从而导致细胞生长和迁移的抑制。癌细胞可以适应由慢性27HC处理带来的代谢压力（Fig.5，右）。存活的细胞(27HC抵抗细胞)增加脂质摄取，并通过上调抵抗脂质氧化应激过程的活性来调节与此活动相关的代谢应激，一种增强肿瘤生长和转移能力的活动。

图6 肿瘤细胞对27HC治疗的反应的机制模型

参考文献：

Liu Wen., Chakraborty Binita., Safi Rachid., Kazmin Dmitri., Chang Ching-Yi., McDonnell Donald P.(2021). Dysregulated cholesterol homeostasis results in resistance to ferroptosis increasing tumorigenicity and metastasis in cancer. Nat Commun, 12(1), 5103. doi:10.1038/s41467-021-25354-4