长链非编码RNA lnc-LEMGC联合DNA-PKcs抑制胃癌转移

   长链非编码RNA （lncRNA）在肿瘤的发生发展中发挥重要作用；然而，它们在胃癌转移中的作用仍然是未知的。目前有作者通过lncRNA芯片筛选，发现差异表达的lncRNA，并通过功能验证和调控机制研究，发现lnc-LEMGC通过直接抑制其结合蛋白DNA-PKcs的磷酸化和使DNA-PKcs下游EGFR信号失活而抑制胃癌转移。该研究于2021年10月发表在《Cancer Letters》，IF：8.679。

技术路线：

主要研究结果：

1. 分析转移性和非转移性胃癌组织之间的lncRNA差异表达谱

为了研究转移性胃癌中lncRNA的整体表达谱，作者进行了lncRNA微阵列分析，以比较5例有淋巴结转移（LNM）的胃癌病例和5例没有LNM的胃癌病例。分层聚类显示样本的非随机分配有两个分支，lncRNA表达的不同模式可能反映胃癌转移的分子机制（图1A）。与非转移性样本相比，转移性胃癌样本中有225个lncRNAs下调，228个lncRNAs上调（fold change≥2， P< 0.05，raw data >50）。

2. Lnc-LEMGC是胃癌转移相关的lncRNA

与无LNM的胃癌组织相比，有LNM的胃癌组织中有五种表达显著上调，其他五种表达显著下调（图1B）。为了验证微阵列分析结果，通过定量PCR（qPCR）证实uc001pqq.1过度表达，而在LNM胃癌组织中AK095500、AK021443和ENST0000398098的表达降低（图1C、D）。作者选择AK095500（lnc-LEMGC）进行进一步研究。在90例具有广泛临床病理参数的原发性胃肿瘤中测定了lnc-LEMGC的表达水平。在转移性胃癌组织中，Lnc-LEMGC表达下调10.7倍，因此，Lnc-LEMGC表达降低与胃癌转移潜能相关（图1E）。在胃细胞系中也检测了lnc-LEMGC的表达水平，表明lnc-LEMGC在高转移人胃癌细胞系SGC 7901中的表达逐步增加，然后是低转移细胞系AGS、KATOII、MKN45、MGC803、BGC823（图1F）。低lnc-LEMGC表达与LNM阳性（P<0.0001）、远处转移阳性（P=0.0032）和AJCC分期（P=0.0333）密切相关。此外，Kaplan-Meier分析显示lnc-LEMGC过表达与生存期更长有关（图1G）。单分子RNA荧光原位杂交显示lnc-LEMGC主要分布在细胞核中，核/细胞质分离证实了这一点（图1H和图I）。因此，低水平的lnc-LEMGC可作为胃癌患者肿瘤转移或预后较差的预测因子。

图1 鉴定与验证lnc-LEMGC作为抗胃癌转移的lncRNA

3. Lnc-LEMGC在体内外均抑制胃癌细胞的侵袭和转移能力

Lnc-LEMGC过表达明显抑制了癌细胞的迁移和侵袭活性（图2A）。在皮下移植模型中，肿瘤侵入高转移性SGC 7901异种移植物的肌肉组织，而lnc-LEMGC过表达组显示局部侵袭活性降低，并表现出良好的包封性。相反，肿瘤在低转移BGC 823异种移植物中包裹良好，而lnc-LEMGC抑制BGC 823组中的肿瘤细胞显示出多部位局部浸润（图2C，顶部）。在同质转移模型中，结果显示lnc-LEMGC的上调显著降低了肺转移定植的发生率。反过来，lnc-LEMGC的缺失显著增加了转移定植（图2C，中间）。在苏木精和伊红（H&E）染色切片中进一步评估肺转移（图2C，底部）。结果表明，lnc-LEMGC抑制胃癌细胞的局部侵袭和远处转移。

图2. Lnc-LEMGC在体内外均抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力

4. Lnc-LEMGC结合DNA依赖的蛋白激酶，催化亚基在抑制肿瘤转移中发挥作用

据报道，lncRNA与蛋白质相互作用，调节分子信号通路。因此，假设lnc-LEMGC可能以类似的方式运行。为了验证这一假设，合成了生物素化的lnc-LEMGC正义和反义链（图3A），并使用RNA-pull down鉴定了lnc-LEMGC结合蛋白。质谱分析显示，lnc-LEMGC-protein 复合物中含有6种蛋白，包括DNA依赖蛋白激酶、催化亚基（DNA-PKcs）、plectin、epiplakin、氨甲酰磷酸合成酶1 （CPS1）、vimentin和ATP5A（图3B）。根据以往的研究，DNA-PKcs和vimentin参与了肿瘤的进展，因此选择它们作为推测的lnc-LEMGC结合蛋白。将被RNA拉下的蛋白进行Western blot分析，检测lnc-LEMGC与DNA-PKcs蛋白的结合。但未观察到lnc-LEMGC和波形蛋白的联合作用（图3C）。 RIP试验表明，与对照IgG相比，抗DNA-PKcs的抗体可以富集lnc-LEMGC（图3D）。因此，lnc-LEMGC与DNA-PKcs直接结合。如上所述，过表达lnc-LEMGC的侵袭率降低，而siRNA介导的DNA-PKcs沉默阻断了这一作用（图3E-H）。这些结果表明lnc-LEMGC与DNA-PKcs联合调控细胞侵袭。其次，采用免疫组化方法分析83例石蜡包埋的原发性胃癌的DNA-PKcs表达与临床病理特征的关系（图3I）。DNA-PKcs蛋白主要在胃癌细胞核中表达。DNA-PKcs阳性表达为lnc-LEMGC抑制胃癌迁移和侵袭。

图3 Lnc-LEMGC与DNA-PKcs联合发挥抑制转移的作用

5. Lnc-LEMGC/DNA-PKcs复合物调控表皮生长因子受体信号

为了确定lnc-LEMGC/DNA-PKcs复合物在抑制肿瘤进展中的作用机制，作者在lnc-LEMGC表达的SGC7901细胞和阴性对照细胞之间进行转录组分析。与阴性对照组相比，lnc-LEMGC过表达的细胞中有1462个基因表达上调，1929个基因表达下调（图4A）。Lnc-LEMGC过表达显著抑制了转化生长因子α生长因子受体（EGFR, ErbB1）通路的mRNA表达（图4B）。在胃癌细胞中，qPCR进一步证实了基因芯片的结果。Lnc-LEMGC过表达组中TGFα、ErbB1、SRC和蛋白酪氨酸激酶2 （FAK）的mRNA表达被抑制（图4C）。此外，lnc-LEMGC的上调抑制了ErbB1、SRC、FAK和磷酸化FAK （p-FAK；图4 d）。此外，Lnc-LEMGC沉默后蛋白表达增加（图4E）。此外，当DNA-PKcs表达被沉默时，可以观察到下游基因ErbB1、SRC、FAK和p-FAK的蛋白表达降低（图4F和G）。这些数据提示lnc-LEMGC/DNA-PKcs复合物通过下调ErbB1、SRC、FAK和pFAK参与的EGFR通路抑制肿瘤转移。

图4 Lnc-LEMGC/DNA-PKcs复合物调控ErbB信号通路。

6. lnc-LEMGC与DNA-PKcs结合抑制后者的磷酸化

为了探讨lnc-LEMGC对DNA-PKcs活性的影响，检测lnc-LEMGC对DNA-PKcs磷酸化的影响。异位lnc-LEMGC表达抑制了2056丝氨酸（S2056）上的DNA-PKcs磷酸化水平，但沉默lnc-LEMGC则增强了其磷酸化水平（图5A和B）。这些结果表明lnc-LEMGC表达与DNA-PKcs磷酸化呈负相关。利用lnc-LEMGC的3’端一系列缺失片段，确定lnc-LEMGC与DNA-PKcs相互作用的区域（图5C）。在RNA-pull down中，Lnc-LEMGC从其3’端缺失至1800 nt与DNA PKcs结合，并抑制DNA PKcs S2056磷酸化。然而，1300-1800 nt中lnc-LEMGC缺失则消除了这些效应（图5D），表明这些nt对于lnc-LEMGC与DNA-PKcs的相互作用至关重要，后者抑制DNA-PKcs磷酸化。通过ATM激酶抑制剂可以抑制DNA-PKcs激酶活性，减少DNA-PKcs S2056的磷酸化（图5E）。此外，当DNA-PKcs磷酸化被抑制时，ErbB1、SRC、FAK和p-FAK的表达水平降低（图5F）。ErbB1、SRC、FAK和p-FAK蛋白表达水平在全长组以及1300-1800 nt片段组均受到抑制（图5G和H）。这些结果表明，lnc-LEMGC 的1300-1800 nt通过抑制S2056磷酸化和灭活EGFR信号来抑制DNA-PKcs的激活。

图5 lnc-LEMGC与DNA-PKcs结合抑制后者的磷酸化

主要结论：

在这项研究中，在有或没有LNM的胃癌组织中lncRNA表达存在显著差异。转移性胃癌组织中Lnc LEMGC显著降低，与胃癌患者的肿瘤转移呈负相关。Lnc-LEMGC的1300-1800 nt片段与DNA-PKcs协同抑制DNA-PKcs S2056磷酸化，并通过下调ErbB1-SRC-FAK信号通路抑制肿瘤转移（图5I）。因此，lnc-LEMGC是胃癌进展的关键调节因子。

参考文献：

Zhang H, Ma RR, Zhang G, et al. Long noncoding RNA lnc-LEMGC combines with DNA-PKcs to suppress gastric cancer metastasis. Cancer Lett. 2021; 524:82-90. doi: 10.1016/j.canlet.2021.09.042