lncRNA ropm介导的脂质代谢控制乳腺癌干细胞的特性

乳腺癌细胞复发、远处转移、化学耐药性是乳腺癌患者死亡的主要原因。肿瘤干细胞（ CSCs ）被认为是肿瘤发生、发展、复发、转移和化疗耐药的“种子”。 lncRNAs通过调节细胞核中的核结构和转录，以及影响细胞质中mRNA的稳定性、翻译和翻译后修饰。本文提出lncROPM及其靶点PLA2G16能调节BCSCs，促进乳腺癌发展、复发和化疗耐药。本文于2021年10月发表在《Journal of hemetology and Oncology》，IF=11.059。

技术路线

主要结果：
1. 新型代谢相关的lncROPM在BCSCs中高表达

作者首先分离了乳腺癌干细胞(CD44+CD24−/low)和非乳腺癌干细胞(CD44−/lowCD24+)，通过微阵列芯片分析LncRNA的表达谱，以Fold change > 2.0 ，p < 0.05为界限，在BCSC中筛选出349个上调及236个小下调的LncRNA（Fig. 1A），由于代谢重编程已成为肿瘤细胞的一个标志，作者从中筛选出23个代谢重编码相关的LncRNA，发现其中的一个lncRNA在BCSC中高表达，并参与磷脂代谢，将其命名为lncROPM（Fig. 1B）。接下来，在7个乳腺癌细胞系中,与Non-CSCs相比，LncROPM在BCSC中表达更显著（Fig. 1C）。通过原位杂交和亚细胞分离实验，发现LncROPM主要定位在细胞质上（Fig. 1D,E）

Fig1. 新型代谢相关的lncROPM在BCSCs中高表达

2. LncROPM在乳腺癌中起致癌作用，与乳腺肿瘤的临床特征及干性密切相关
  作者进一步研究lncROPM在乳腺癌中的临床意义。发现lncROPM在死亡患者中的表达量高于存活患者（Fig. 2A），通过无病生存期和无进展生存期进行生存分析，发现高水平的LncRoPM往往与预后差相关（Fig. 2B,C），此外，lncROPM在乳腺癌三阴患者中的表达与无病生存率、无进展生存率也呈负相关（Fig. 2D,E）。与癌旁组织相比，乳腺癌组织中ROPM明显上调(Fig. 2E), 而ROPM的表达水平与肿瘤大小、肿瘤分期、组织分解、淋巴转移情况、复发情况也密切相关，病情越严重，ROPM表达越明显(Fig. 2G)。接下来作者研究了ROPM的表达量与干性标记物Sox2, Oct4之间的相关性，发现他们是成正相关(Fig. 2H,I)。lncROPM在非BCSCs和BCSCs中的表达，结果显示，与非BCSCs相比，lncROPM在BCSCs中的表达明显增加，尤其是在恶化程度高的乳腺癌干细胞中表达更显著(Fig. 2J)，此外，相比于化疗敏感的肿瘤组织，化疗耐药的乳腺肿瘤组织中lncROPM显著升高(Fig. 2 K)。

Fig2. LncROPM是一种与乳腺癌患者的临床特征及干性相关的致癌基因

3．LncROPM是维护BCSC所必需的

为了探讨lncROPM在BCSCs中的作用，作者在BCSCs中使用两种慢病毒介导的短发夹RNA (shRNAs)敲除了lncROPM（Fig. 3A），并且将异位lncROPM与携带慢病毒的lncROPM转染至非bcscs（Fig. 3B），在BCSC中敲除lncROPM之后，肿瘤明显变小，乳腺球形成率降低（Fig. 3C,D）。将异位lncROPM与携带慢病毒的lncROPM转染至non-BCSC之后，肿瘤明显变大，乳腺球形成率提高（Fig. 3E,F）。接下来，通过限制性稀释法检测lncROPM在体内外对肿瘤起始的影响，发现在乳腺癌干细胞中，lncROPM的缺失明显损害了体外和体内的肿瘤启动能力（Fig. 3G,H），而在非乳腺癌干细胞中，异位lncROPM启动肿瘤形成能力（Fig. 3I,J）。说明LncROPM是维护BCSC所必需的。

Fig3 LncROPM是维持BCSCs特性所必需的

4. PLA2G16是lncROPM的靶点，能促进乳腺癌的发展和化疗耐药
  为了探讨lncROPM调控BCSCs特性的机制，通过生物信息学分析和qRT-PCR实验预测lncROPM的潜在靶基因，我们发现其邻近基因PLA2G16是lncROPM的潜在靶基因，下一步，为了进一步检测lncROPM是否会影响PLA2G16的表达，我们再不同的细胞系中进行了qRT-PCR和western blotting检测，发现在BCSC中敲除lncROPM之后明显抑制了PLA2G16及其蛋白的表达（Fig. 4A,C），而将异位lncROPM转染至non-BCSC之后，明显促进了PLA2G16及其蛋白的表达（Fig. 4B,D），通过相关性分析，发现lncROPM和PLA2G16在临床样本中表达呈正相关（Fig. 4E）。作者通过TNM分期、组织学分级、淋巴结转移、肿瘤复发情况与PLA2G16表达量，分析了PLA2G16表达水平与临床病理严重程度之间的关系，发现PLA2G16表达水平 与临床病理严重程度成正相关（Fig. 4F），此外，在耐药乳腺肿瘤组织中也观察到较高水平的PLA2G16（Fig. 4G）。通过对GEO数据库的分析，作者进一步发现，与对新辅治疗具有完全病理应答的乳腺癌组织相比，在对新辅助治疗具有部分应答的乳腺癌组织中，PLA2G16增强，这表明PLA2G16与乳腺癌患者预后不良和化疗耐药性密切相关（Fig. 4H）。说明了PLA2G16是lncROPM的靶点，能促进乳腺癌的发展和化疗耐药

Fig4. PLA2G16是lncROPM的靶点，与乳腺癌的发展和化疗耐药有关

5. LncROPM通过增强PLA2G16 mRNA的稳定性来调控其表达
   之前发现LncROPM 是定位在染色质上的，作者推测lncROPM可能在转录后水平影响PLA2G16的表达。为了验证这一假设，首先通过qRT-PCR分析检测了LncROPM缺失的BCSCs中PLA2G16 pre-mRNA和成熟mRNA的水平。结果表明，lncROPM的缺失使PLA2G16的CDS区，5‘-UTR，3‘-UTR水平明显降低，但3个内含子水平没有明显变化。说明 LncROPM参与PLA2G16转录后调控（Fig. 5A，B）。根据pull down实验发现lncROPM与PLA2G16 3‘-UTR结合（Fig. 5C）。接下来，作者将3‘-UTR分为两部分，即3‘-UTR-1和3‘-UTR-2，荧光素酶报告基因检测显示，lncROPM的下调或过表达显著降低或增强了3‘-UTR-1的活性，而不是3‘-UTR-2的活性，说明LncROPM是与3‘-UTR-1区域结合（Fig. 5E，F），构建了一套lncROPM片段质粒，分别与3 ‘-UTR-1质粒共转染,确定了与3 ‘-UTR-1结合的主要是lncROPM 1-100nt（Fig. 5G）。接下来，利用转录抑制剂放线菌素d检测了lncROPM对PLA2G16 mRNA稳定性的影响，发现lncROPM耗尽后PLA2G16 mRNA半衰期迅速降低(Fig. 5H, I)。说明LncROPM通过增强PLA2G16 mRNA的稳定性来调控其表达。

Fig5. LncROPM结合PLA2G16 mRNA的3'UTR，增强PLA2G16 mRNA的稳定性

6. PLA2G16对于lncROPM驱动的BCSCs特性至关重要
  为了了解PLA2G16是否调控BCSC特性，首先通过qRT-PCR和western blotting检测，发现临床样品和不同的细胞系中，相较于Non-CSCs，PLA2G16及其蛋白的表达在BCSC中更显著（Fig. 6 ABC）。接下来，通过慢病毒构建2个稳定干扰的PLA2G16 乳腺癌细胞系,以及稳定的PLA2G16过表达的非乳腺癌细胞系。Giripladib是一种细胞质磷脂酶A2抑制剂，能抑制PLA2G16酶的活性，发现在BCSC中敲除PLA2G16或者使用Giripladib能显著降低连续传代过程中乳腺球形成效率（Fig 6D,F）, 在non-BCSC中过表达PLA2G16能加速连续传代过程中乳腺球的形成效率（Fig 6E,G）。挽救实验发现，因ROPM缺失而造成的干细胞自我更新能力降低，乳腺球形成率降低 ，能通过异位的PLA2G16可以部分挽救（Fig 6H），在ROPM过表达的non-BCSC中干扰PLA2G16也能明显逆转（Fig 6 I）。说明PLA2G16对于lncROPM驱动的BCSCs特性至关重要。

Fig 6. PLA2G16是lncropm驱动BCSCs形成的关键

 7.LncROPM通过PLA2G16 介导磷脂代谢调控促进BCSCs的干性

   已有文献报道PLA2G16参与磷脂代谢过程，为了了解LncROPM是否通过诱导的磷脂代谢的改变而影响BCSC的特性,以及哪些代谢物起了关键作用，于是进行了脂质组学研究。发现在BCSC中 敲除LncROPM后，PLA2G16的两种代谢底物PC(磷脂酰胆碱)和PG(甘油磷酸甘油)显著增加，PLA2G16的两种代表性代谢物Cer(神经酰胺)和FFA(自由脂肪酸)显著降低。而在lncROPM沉默的BCSCs中，PC和PG显著降低，Cer(神经酰胺)和FFA(自由脂肪酸)显著升高（Fig. 7 A,B）。FFA因为变化最大作为研究对象， FFA前五个变化显著的代谢物中，花生四烯酸(AA)变化最显著（Fig. 7 C,D）。为了证实AA与PLA2G16密切相关，在PLA2G16敲除或giripladib处理的BCSCs以及PLA2G16过表达的非BCSCs中检测AA含量，发现AA受PLA2G16调控(Fig. 7E, F)。与此同时,与non-BCSCs相比，AA在BCSCs中显著富集(Fig. 7G)。

Fig 7. PLA2G16介导的磷脂代谢和代谢产物花生四烯酸(AA)参与了lncropm驱动的BCSCs维持

8. Giripladib联合化疗药物可有效清除BCSCs

为了进一步验证lncROPM和PLA2G16在乳腺癌耐药中的作用，我们研究了lncROPM和PLA2G16在化疗药物反应中对BCSCs生存的影响。我们的数据显示lncROPM或PLA2G16的敲低增加BCSCs对化疗药物的敏感性(Fig. 8A, B)。此外，lncROPM或PLA2G16在non-BCSC中的过表达降低了其对化疗药物的敏感性(Fig. 8C, D)。接下来发现与亲本相比，耐药的BCSCs中检测到和PLA2G16表达更明显，这些BCSCs具有较强的干性(Fig. 8E)。Giripladib联合药物一起使用，与单一用药物相比，能更有效地减少BCSCs数量，抑制乳腺球生成(Fig. 8F,G)。体内实验也发现联合使用能显著降低BCSC的致瘤性，抑制肿瘤生长(Fig. 8H,I)。此外，通过免疫组织化学 (IHC)染色，发现接受联合治疗的肿瘤中代表性BCSC蛋白之一的干细胞相关转录因子KLF4显著降低 (图8J)。

Fig 8. Giripladib联合临床治疗药物有效消除BCSCs

   本文发现lncROPM, PLA2G16和花生四烯酸（ AA ）与BCSCs耐药有关，细胞质磷脂酶A2抑制剂Giripladib与化疗药物协同可通过抑制PLA2G16活性有效消除BCSCs。

参考文献：
      1.    Liu S, Sun Y, Hou Y, Yang L, Wan X, Qin Y, Liu Y, Wang R, Zhu P, Teng Y, Liu M. A novel lncRNA ROPM-mediated lipid metabolism governs breast cancer stem cell properties. J Hematol Oncol 2021; 14(1): 178.