多发性骨髓瘤PRMT5通过沉默CASP1调节细胞焦亡

多发性骨髓瘤（MM）是一种恶性肿瘤，起源于骨髓中产生病理性抗体的浆细胞的广泛增殖，约占血液肿瘤的10%。目前，许多研究已经证明，MM患者具有相同的遗传特征；因此，MM被认为是遗传变异累积的结果。然而，MM的发展是一个复杂的病理过程，需要进一步研究。蛋白精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）是一种参与多种血液恶性肿瘤肿瘤细胞进展的酶。有研究发现抑制PRMT5的活性增加了CASP1的表达，促进了MM细胞焦亡。PRMT5的高表达或CASP1的低表达与MM的总体生存率低相关。该研究2021年9月发表在《Cell Death and Disease》，IF: 8.469。

技术路线：

主要研究结果：

1.   PRMT5在MM中过表达

作者对来自Oncomine数据库的7个MM数据集进行了生物信息学分析。与非癌组织相比，发现MM组织中PRMT5显著上调（P=0.020，图1A）。此外，结合MMRF CoMMpass（n=859）和基因型组织表达（GTEx）数据库（n=62）进行了生物信息学分析，表明PRMT5在MM组织中的表达高于非癌组织（P=0.00034，图1B）。通过分析MMRF CoMMpass数据库中787例MM患者的临床数据，发现高PRMT5表达与较差的无进展生存率相关（P=0.015，HR=1.472，图1C）。PCR结果同样发现MM样品中的PRMT5水平显著高于对照样品，而MGU样品中未观察到显著变化（图1D）。包括MGUS样本（GSE6477和GSE5900）在内的数据集显示，健康和MGUS患者之间PRMT5的表达没有差异。此外，通过使用蛋白质印迹分析，发现PRMT5蛋白在MM样本和MM细胞系中过度表达（图1E，F）。

图1 PRMT5在MM中过表达

2.  PRMT5基因敲除触发MM细胞膜破裂和PI+/Annexin V+增加

设计干扰PRMT5表达的实验，通过western blotting和qRT-PCR验证（图2A，B），并且这些结果在两种细胞系中靶向PRMT5的免疫荧光也进一步证实（图2C）。通过流式细胞术证实，敲除PRMT5可增加NCI-H929和U266细胞的PI+数量，尤其是在PI+/Annexin V+结构域（图2D）。这种表型可能是指晚期凋亡或焦亡，两者都表现为细胞膜两极引起的PI染色。由于CASP3的激活是细胞凋亡执行途径的触发因素，作者分析了sh-PRMT5细胞和阴性对照细胞中裂解的CASP3的表达，但结果无显著性（图2E）。此外，TEM图像显示sh-PRMT5细胞具有细胞质肿胀和质膜破裂，这支持了细胞焦亡的形态学（图2F）。这些结果表明，PRMT5的敲除激活MM细胞系的焦亡。

图2 PRMT5激活MM细胞系焦亡

3.   PRMT5上调与CASP1呈负相关

使用Affymetrix Clariom S阵列芯片对三个NCI-H929细胞样本和三个PRMT5敲除（PRMT5 kd）NCI-H929细胞样本进行基因组阵列，以确定PRMT5在MM发病机制中的功能（图3A）。结果显示，NCI-H929和U266细胞中的CASP1均显著增加（图3B）。为了证实CASP1作为PRMT5的下游靶点，与阴性对照组相比，作者评估了转染PRMT5-shRNA-2后MM细胞系中CASP1和裂解的CASP1的蛋白表达水平。值得注意的是，PRMT5的敲除导致CASP1和裂解的CASP1显著升高，表明在MM细胞中，PRMT5使CASP1沉默（图3C）。此外，MM患者骨髓源浆细胞CASP1 mRNA表达显著降低，与PRMT5呈负相关（图3D, E）。

图3 PRMT5上调与CASP1呈负相关

4.   在MM细胞系中敲除CASP1可以挽救PRMT5缺失引起的焦亡现象

为了研究PRMT5是否通过抑制CASP1表达来调节细胞热下垂，在NCI-H929和U266细胞中瞬时过表达CASP1（图4A）。结果显示，CASP1过表达显著抑制了NCI-H929和U266细胞的细胞活力（补充图1B），并增加了PI+/Annexin V+细胞的数量（图4B）。结果表明，CASP1的过度表达增强了GSDMD的激活和白细胞介素-1β（IL-1b）和白细胞介素-18（IL-18）的分泌（图4C）。同样，在PRMT5缺失的细胞中，CASP1表达升高，激活了焦亡途径。然而，当PRMT5缺失细胞中的siRNA敲除CASP1时（图4D），焦亡途径的标记物显著下调，焦亡细胞的百分比显著降低（图4E，F）使用小鼠异种移植模型进行了体内实验，发现CASP1的敲除部分逆转了体内PRMT5缺失的NCI-H929细胞的增殖缺陷（图4G，H）。上述结果表明，PRMT5缺失引起的细胞焦亡通过敲除CASP1得以挽救。

图4通过敲除CASP1挽救了PRMT5缺失引起的细胞焦亡

5.  使用PRMT5抑制剂GSK591处理可降低CASP1启动子H4R3me2s水平

检测PRMT5是否直接调控CASP1的表达，并通过ChIP检测和qRT-PCR分析了PRMT5介导的H4R3me2s在CASP1基因启动子周围的富集情况。结果表明，与对照组相比，在PRMT5缺失的NCI-H929和U266细胞中，CASP1启动子区域的H4R3me2s水平显著降低（图5A）。为了抑制CASP1基因启动子上的H4R3me2s，用PRMT5的特异性抑制剂-GSK591处理NCI-H929和U266细胞。用0、1、5和10μM GSK591（B6182，Apexbio）处理NCI-H929和U266细胞，以研究其生物学功能。结果发现，5μM GSK591处理显著触发NCIH929和U266细胞中PI+细胞比例的增加，表明膜破裂和继发性细胞死亡由热下垂引起（图5B）。接下来，作者检测了不同浓度GSK591处理的NCI-H929和U266细胞中CASP1的表达，以探讨抑制PRMT5的酶活性是否可以重新激活CASP1的表达。发现5μM GSK591增加了CASP1的表达（图5C）。这些结果表明，GSK591通过抑制PRMT5降低H4R3me2s水平，从而激活CASP1介导的细胞焦亡。

图5 PRMT5抑制剂GSK591处理后CASP1启动子H4R3me2s水平降低

6.  PRMT5的高表达和CASP1的低表达与MM患者较差的临床预后相关

作者收集了108例新诊断的MM患者的临床资料，并通过免疫组织化学测定了PRMT5和CASP1的表达水平。MM患者的骨髓组织分为PRMT5高组和PRMT5低组（图6A），以及CASP1高组和CASP1低组（图6B）。在MM患者中观察到PRMT5表达与ISS分期之间存在显著相关性（表1）。此外，Kaplan-Meier曲线（图6C，D）表明，高PRMT5表达（P=0.022）和低CASP1表达（P=0.00063）与MM总体存活率低相关。合并这两种变体，发现与PRMT5高表达和CASP1低表达的患者相比，PRMT5低表达和CASP1高表达的患者的生存率显著降低（图6E，P=0.0037）。此外，单变量（P<0.001）和多变量（P=0.007）Cox比例风险回归分析均表明PRMT5上调是MM患者生存率低的独立预后风险因素（表2）。

图6 在MM患者中，PRMT5的高表达和CASP1的低表达与较差的临床预后相关

表1 PRMT5表达与MM临床病理特征的关系

表2 MM患者生存的单因素和多因素临床病理特征分析

主要结论：

该研究结果表明，PRMT5通过沉默CASP1在MM中调节细胞焦亡，PRMT5抑制剂GSK591可能作为MM的潜在治疗药物。

参考文献：

Xia T, Liu M, Zhao Q, Ouyang J, Xu P, Chen B. PRMT5 regulates cell pyroptosis by silencing CASP1 in multiple myeloma. Cell Death Dis. 2021; 12(10):851.