ADAR1限制ZBP1介导的免疫应答和PANoptosis以促进肿瘤发生
细胞死亡提供宿主防御并维持体内平衡。Z-DNA结合蛋白1 (ZBP1)激活炎症性细胞死亡(PANoptosis)，而作用于RNA 1的腺苷脱氨酶(ADAR1)作为RNA编辑器维持体内平衡。最新研究结果表明，ADAR1抑制ZBP1介导的PANoptosis，促进肿瘤的发生。明确ADAR1和ZBP1在细胞死亡中的功能对于制定癌症和其他疾病的治疗策略至关重要。该研究发表2021年10月发表在《Cell Reports》，IF:9.423。
技术路线：
主要研究结果：
1. IFN信号转导增强核转运抑制剂诱导的细胞死亡
前期大量文献证明了NEIs诱导的细胞死亡途径对于理解NEIs抑制肿瘤发生的分子机制至关重要。为了确定NEIs是否能诱导细胞死亡，用NEIs KPT-330或LMB治疗骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）。KPT-330或LMB治疗24小时后，BMDM中的细胞死亡水平较低（图1A和1C）。而与单独使用KPT-330或LMB治疗相比，IFN-b或IFN-g联合KPT-330或LMB治疗增加了细胞死亡的发生率（图1A- 1C），这表明IFN信号增强了NEIs诱导的细胞死亡。
另外，用NEIs处理可产生少量活性GSDMD P30片段，仅对NEIs反应时，caspase-1和caspase-11的切割量最小，与产生的GSDMD P30的数量一致（图1D）。除了pyroptosis，还发现KPT-330或LMB诱导BMDM中凋亡效应物的激活，如凋亡的caspase-8、-3和-7的裂解（图1E）。用KPT-330或LMB刺激的细胞显示MLKL的低水平磷酸化（图1F），表明坏死效应物的激活正在发生。
与细胞死亡的发生率一致，IFN-b或IFN-g治疗可增强KPT-330-或LMB诱导的caspase-1和GSDME的裂解(pyroptosis)；caspase-8、-3和-7的裂解(apoptosis);和MLKL磷酸化(necroptosis)（图1D-1F）。总的来说，这些数据表明，IFN与NEIs联合使用可使细胞发生炎性小体激活和细胞死亡，包括焦亡、凋亡和坏死，表明PANoptosis正在发生。
图1. 干扰素增强核输出抑制剂诱导的细胞死亡
2. ZBP1参与RIPK3信号通路激活NLRP3炎症小体和NEIs诱导的PANoptosis
在IFN-b和NEI治疗后，与野生型（WT）BMDM相比，缺乏ZBP1的BMDM减少了细胞死亡（图2A、2C）。与这种保护作用相一致，Zbp1–/– BMDMs显示pyroptotic, apoptotic, 和 necroptotic分子的激活减少（图2D-2F），表明Zbp1是IFN-和NEI诱导的NLRP3炎症小体激活和PANoptosis所必需的。此外，使用IFN-b和KPT-330或IFN-b和LMB治疗后，结果与IFN-b和NEI治疗后一致。
图2. ZBP1在IFN和核出口抑制剂的联合作用下触发炎症小体激活和细胞死亡
3. ADAR1抑制ZBP1介导的NLRP3炎症小体激活和PANoptosis
从髓系细胞中缺乏ADAR1的小鼠(ADAR1 / BMDMs)中获得BMDMs，以研究ADAR1在NEI介导的炎症小体激活和PANoptosis中的作用。与WT和Zbp1–/–细胞相比，缺乏ADAR1的细胞中IFN-b和KPT-330或IFN-b和LMB联合诱导的细胞死亡增加（图3A和3B）。此外，与WT和Zbp1–/–BMDM相比，缺乏ADAR1的BMDM加速了细胞死亡（图3A）。尽管ADAR1-p150和ZBP1都是IFN可诱导且包含Za结构域，这些分子在细胞死亡方面表现出不同的表型：ZBP1的丢失抑制细胞死亡，ADAR1的丢失促进细胞死亡(图2、3A和3B)。
单独使用KRT -330或LMB治疗后，Adar1 / BMDMs细胞死亡增加（图3C和3D）。Adar1–/– BMDMs增加了caspase-1的裂解和pyroptotic分子GSDME的活化；apoptotic的caspase；以及单独使用KRT -330或LMB处理后的坏死分子MLKL（图3E-3G），提示ADAR1抑制NEIs诱导的NLRP3炎症小体激活和PANoptosis。同时缺乏ADAR1和ZBP1的BMDMs在KPT-330或LMB作用下的细胞死亡与WT细胞相似（图4A和4B）。此外，NEIs处理的Adar1–/– BMDMs中，ZBP1的缺失抑制了NLRP3炎症小体的激活以及焦亡、凋亡和坏死效应物的激活（图4C-4E）。
图3. ADAR1缺陷导致核输出抑制剂导致细胞加速死亡
图4. 缺失ZBP1拯救ADAR1缺陷细胞中核输出抑制剂诱导的炎症体激活和细胞死亡
4. IFNs促进NEIs产生EREs并激活ZBP1
经KPT-330或LMB处理后，Adar1–/– BMDMs中的dsRNA数量增加（图5A和5B）。为了测试KPT-330或LMB处理是否能诱导ERE衍生的dsRNA，结果显示用KPT-330或LMB处理Adar1–/– BMDM可增加ERE的表达（图5C）。与培养基处理的WT细胞相比，单独使用KPT-330或LMB处理的WT细胞增加了dsRNA水平（图5D）。然而，与PBS、KPT-330或LMB处理的WT细胞相比，IFN-b和KPT-330或IFN-b和LMB的组合更有力地增加了dsRNA（图5D和5E）。此外，单独使用KPT-330或LMB治疗的细胞中，ERE的表达上调，在联合使用IFN-b和KPT-330或IFN-b和LMB治疗的细胞中更显著地增加（图5F）。
图5. IFN信号通过核出口抑制剂增强双链RNA (dsRNA)的积累
5. ADAR1与RIPK3竞争ZBP1结合抑制炎症小体激活和细胞死亡
在IFN-b刺激下，ADAR1和ZBP1的表达上调（图6A）。此外，LMB治疗能够诱导ADAR1和ZBP1的表达，但不如IFN-b刺激那么强烈（图6A）。在基础条件下未观察到ZBP1和ADAR1之间的相互作用（图6B）。然而，在IFN-b刺激的WT细胞中，观察到ZBP1与ADAR1的强烈相互作用，而不是与RIPK3的强烈相互作用（图6B）。虽然单独使用KPT-330或LMB处理的WT细胞显示出ZBP1与ADAR1和RIPK3都有一定的相互作用，但IFN-b与KPT-330或LMB联合刺激则减少了ZBP1与ADAR1的相互作用，增加了ZBP1与RIPK3的相互作用（图6B）。
WT ZBP1与ADAR1共免疫沉淀显示ZBP1与RHIM或C末端结构域相互作用（图6C）。在WT BMDM中未检测到ADAR1和ZBP1或RIPK3和ZBP1之间的任何相互作用（图6D）。经IFN-b和KPT-330或IFN-b和LMB治疗后，ZBP1与WT BMDM中的ADAR1和RIPK3相互作用（图6B和6D）。然而，在缺乏ADAR1的情况下，ZBP1和RIPK3之间的相互作用增加（图6D和S6D）。此外，与WT细胞相比，Ripk3–/–细胞中ZBP1和ADAR1之间的相互作用增加（图6D），表明ADAR1与Ripk3竞争结合ZBP1。此外，在缺乏其Za2结构域的情况下，在经IFN-b和KPT-330治疗的BMDM中，ZBP1没有与RIPK3相互作用（图S6E），这表明ZBP1的Za2结构域是促进ZBP1和RIPK3的RHIM结构域之间相互作用所必需的。在BMDMs中沉默PKR，并使用IFN-b与KPT-330或LMB联合治疗，观察到细胞死亡没有差异(图S6F)，表明这是一个PKR独立的机制。
图6. ADAR1与RIPK3竞争与ZBP1的结合
6. ADAR1通过抑制ZBP1介导的炎症细胞死亡促进肿瘤发生
与同窝对照小鼠相比，Adar1fl/flLysMcre小鼠结肠的肿瘤负担在肿瘤数量和肿瘤大小方面都较低（图7A-7C）。Adar1fl/flLysMcreZbp1–/–小鼠显示出与对照小鼠相似的肿瘤负担（图7D 7F）。此外，ZBP1 Za2结构域的缺失产生了类似的结果（图7D-7F），表明ZBP1 Za2结构域在抑制骨髓细胞中缺乏ADAR1的小鼠的结直肠肿瘤发生中至关重要。
关于IFN和NEIs治疗黑色素瘤的疗效方面。B16黑色素瘤细胞植入后8天用KPT-330治疗的WT小鼠显示黑色素瘤生长减少（图7G和7H）。此外，IFN-g和KPT-330联合治疗的小鼠肿瘤消退显著改善（图7G和7H）。为了确定肿瘤消退是否依赖于ZBP1，将IFN-g和KPT-330联合应用于WT和ZBP1/小鼠。IFN-g和KPT-330未能使Zbp1–/–小鼠中的黑色素瘤消退（图7I）。ZBP1的Za2结构域的缺失产生了类似的结果（图7I），表明ZBP1，尤其是其Za2结构域，对于抑制IFN和NEIs联合治疗的肿瘤发生至关重要。
图7. ADAR1-ZBP1相互作用的调节影响肿瘤的发生
主要结论：
这项研究结果表明ADAR1通过抑制ZBP1介导的炎症细胞死亡和PANoptosis，作为一个限制抗肿瘤免疫的检查点，并提示影响ADAR1-ZBP1相互作用的策略，如使用IFN和NEIs治疗可能是有前景的。这些结果提供了更深入的理解细胞死亡的细胞和分子机制，特别是PANoptosis，并将为发展有效的治疗策略对抗癌症提供重要的信息。
参考文献：
Karki R, Sundaram B, Sharma BR, Lee S, Malireddi RKS, Nguyen LN, Christgen S, Zheng M, Wang Y, Samir P, Neale G, Vogel P, Kanneganti TD. ADAR1 restricts ZBP1-mediated immune response and PANoptosis to promote tumorigenesis. Cell Rep. 2021; 37(3):109858. doi: 10.1016/j.celrep.2021.109858. PMID: 34686350.