凋亡细胞外囊泡通过恢复Fas介导的凋亡改善多发性骨髓瘤
细胞凋亡是维持机体内环境稳定的关键，并产生大量凋亡细胞外小泡（apoEV）。几种类型的癌细胞表面由于Fas表达减少，因此能够逃避Fas配体诱导的凋亡。然而，正常细胞来源的载脂蛋白EV是否能调节肿瘤生长尚不清楚。目前，有研究确定了apoEV在诱导多发性骨髓瘤（MM）凋亡中的作用，并提示了apoEV治疗MM的潜力，该研究发表于2012年9月发表在《ACS NANO》，IF：15.881。
技术路线：
主要研究结果：
1. ApoEVs抑制多发性骨髓瘤进展
作者前期先分离与表征MSC衍生apoEVs。然后为了在体内测试MSC来源的apoEVs对MM的影响，作者通过尾静脉将5TGM1骨髓瘤细胞输注到NOD/SCID小鼠中，生成一个具有侵袭性的同基因MM小鼠模型（图1A）。另外还发现apoEVs显著延长MM小鼠的寿命、抑制肿瘤生长（图1B-D）。免疫荧光染色和流式细胞分析进一步证实，与对照组相比，MM小鼠股骨骨髓中CD138+浆细胞和CD45+CD19 CD138+骨髓瘤细胞数量增加，ApoEVs显著抑制MM小鼠病理浸润的骨髓瘤细胞（图1E，F）。ELISA分析显示，apoEV治疗显著降低MM小鼠升高的IgG2b水平（图1G）。MicroCT和组织学分析显示，5TGM1细胞接种后25天，骨小梁骨密度(BMD)和骨小梁体积分数下降，ApoEVs输注显著恢复MM小鼠的骨密度和BV/TV（图1H，I）。此外，组织学分析显示MM小鼠表现出严重的急性肾损伤，而apoEV治疗显著挽救了肾损伤（图1J）。
图1间充质干细胞来源的apoEVs抑制MM细胞生长
2. ApoEVs利用FasL诱导多发性骨髓瘤细胞细胞凋亡
ApoEV在体外治疗后6、24和48 h以剂量依赖性的方式诱导5TGM1细胞死亡（图2A）。此外，流式细胞仪分析显示，apoEV处理提高了Annexin v阳性的凋亡5TGM1细胞数量，并呈剂量依赖性（图2B）。通过TUNEL染色和Western blotting检测，ApoEV处理显著诱导5TGM1细胞凋亡，上调cleaved caspase-3和cleaved caspase-8的表达（图2C，D）。ApoEV处理显著增加了股骨中cleaved caspase-3和CD138双阳性凋亡骨髓瘤细胞的数量（图2E）。ApoEV轻微提高了5TGM1细胞FasL和Fas的表达，而apoEVs显著提高了5TGM1细胞FasL相关死亡域蛋白的表达，降低了抗凋亡蛋白的表达水平(图2F)。与MSCs和5TGM1细胞相比，MSC来源的apoEV显示FasL和Fas的表达升高(图2G)。FaslprMSC-衍生的 Fas-deficient apoEV能够诱导5TGM1细胞凋亡（图2H，I）。为使用Fasl小干扰RNA (siRNA)产生Fasl-depletion apoEVs，通过流式细胞分析评估发现，它们未能诱导5TGM1细胞凋亡（图2J）。挽救Fasl表达可恢复Faslmut - apoEV诱导5TGM1细胞凋亡的能力（图2K），提示Fasl是apoev诱导骨髓瘤细胞凋亡所必需的。
图2 ApoEVs通过FasL/Fas途径诱导MM细胞凋亡
3. FasL在apoev介导的多发性骨髓瘤治疗中是必需的
Fasl缺陷的Faslmut-apoEVs未能延长MM小鼠的寿命，也未能抑制肿瘤生长（图3A，B）。ELISA分析、MicroCT和组织学分析显示，Fasl缺陷Faslmut-apoEVs未能降低MM小鼠血清IgG2b水平，以及挽救BMD、BV/TV和肾脏损伤（图3D-F）。而挽救Fasl表达可以恢复Fasl缺陷的apoEVs受损的治疗能力 (图3A, B)。组织学分析显示，Fasl过表达恢复了Fasl缺陷apoev的能力，降低血清IgG2b水平，恢复MM小鼠的BMD、BV/TV和肾脏损伤（图3C-F）。
图3 ApoEVs在小鼠体内通过FasL诱导MM细胞凋亡
4. ApoEVs促进Fas从细胞质到多发性骨髓瘤细胞表面的运输
Fas激活抗体和重组FasL均未能诱导5TGM1细胞凋亡，提示MM细胞中Fas激活通路被破坏（图4A）。Fas分布在5TGM1细胞的整个细胞质中，并且pkh26标记的apoEVs聚集在骨髓瘤细胞表面，并诱导细胞表面Fas明显聚集（图4B）。Western blotting结果显示，apoEV处理提高了MM细胞细胞膜上Fas的表达，但降低了细胞质中Fas的水平（图4C）。流式细胞分析进一步证实apoEVs增加了5TGM1细胞表面的Fas表达（图4D）。ApoEVs在MM小鼠股骨骨髓中诱导Fas膜移位（图4E，F）。ApoEVs输注后，Fas明显转移到CD138阳性的骨髓浆细胞表面（图4E）。流式细胞分析也证明apoEVs显著增加了MM小鼠CD138+骨髓浆细胞表面Fas的比例（图4F）。
图4 ApoEVs诱导Fas进入细胞膜。
5. ApoEVs直接接触MM细胞，通过引起Ca2+内流和胞浆Ca2+升高诱导Fas膜运输
在apoEV处理后的6小时内，大多数apoEVs直接与5TGM1细胞表面区域接触，而在这段处理后的时间内，只有少数apoEVs可以在细胞质中发现(图5A)。Z-stack two-dimensional SIM显微镜图像和定量分析证实，许多apoEVs与细胞表面重叠，但不在细胞表面内部(图5B,C)。ApoEV处理显著增加了5TGM1细胞内的钙离子 (图5D)。ApoEV处理增强了5TGM1细胞中Cav1.2和Cav1.3的膜表达，但降低了它们的细胞质表达，而Cav1.1的表达没有改变（图5E）。ApoEV介导的细胞内钙内流被L型Ca2+通道抑制剂阻断，并被L型钙通道激活剂激活（图5 F，G），表明apoEV诱导的Ca2+内流依赖于L型钙通道。最重要的是，通过流式细胞术分析、免疫荧光染色和Western blotting（图5F-I）评估，L型Ca2+通道抑制剂处理5TGM1细胞可阻断apoEV治疗后Fas的细胞表面易位，降低了apoEV治疗后5TGM1细胞凋亡，而BayK处理增强了凋亡（图5J）。
图5 apoEV诱导的Fas运输到细胞膜依赖于Ca2+的流入
6. 骨髓瘤细胞来源的apoEVs未能改善多发性骨髓瘤
5TGM1MM细胞来源的apoEVs未能延长MM小鼠的寿命(图6A)。MicroCT分析显示，与MSC来源的apoEVs相比，5TGM1细胞来源的apoEVs未能挽救BMD和BV/TV的下降(图6B,C)。5TGM1细胞源apoEVs在体外不能增加MM细胞膜中Fas的表达，也不能诱导MM细胞凋亡(图6D,E)。此外，5TGM1细胞来源的apoEVs表达的FasL水平明显低于MSC来源的apoEVs(图6F)。来自MSCs的apoEVs，而不是来自MM肿瘤细胞的apoEVs，可以诱导MM细胞凋亡和改善MM表型。因此，MSCs是临床前和临床研究中产生apoEVs的合适细胞来源。
图6 5TGM1细胞源apoEVs对MM细胞的影响
主要研究结论：
MSC来源的外源性apoEVs可以通过激活FasL/ Fas信号通路抑制MM细胞生长，减轻骨髓瘤骨病。此外，apoEVs通过提高MM细胞的胞质Ca2+，促进Fas蛋白从细胞质运输到细胞膜。apoEV诱导Fas转位至MM细胞膜，apoEV表面FasL直接诱导MM细胞凋亡。这种一箭双雕的效应可能为MM的治疗策略提供了一种很有前途的方法。这一发现为目前对EVs和肿瘤相互作用的理解提供了见解，并为MSC来源的apoEV具有作为无细胞治疗肿瘤的潜力提供了证据。