caspase-4非典型炎症小体的胞质固有免疫感应促进细胞衰老

   人类细胞中微生物脂多糖(LPS)的胞质识别是由caspase-4和caspase-5非典型炎症小体引起的，它们诱导一种称为焦亡的炎症细胞死亡形式。目前，有研究发现LPS介导的caspase-4的激活也会诱导应激反应，促进细胞衰老，这依赖于caspase-4底物gasdermin-D和肿瘤抑制因子p53。该研究发表在《Cell Death & Differentiation》，IF：15.828。

技术路线：

主要研究结果：

1． Caspase-4识别LPS诱导人二倍体成纤维细胞衰老

为了检测炎症性caspases在LPS转染后获得衰老表型中的作用，在转染前用shRNA下调CASP1或CASP4的表达(图1A)。与caspase-1相比，caspase-4在获得衰老特征方面是必需的(图1B-D)。然而，CASP4的过表达加剧了细胞内LPS存在下的衰老特征的获得(图1E, F)，表明caspase-4的表达对非典型炎症小体诱导的衰老至关重要。caspase-4和gasdermin-D的下调，会导致LPS转染介导的细胞死亡，这证实了细胞因焦亡而死亡（图1G）。总之，这些结果表明，细胞内LPS暴露后的衰老表型的获得是通过caspase-4介导的，且呈剂量依赖性。

通过shRNA，研究caspase-4底物gasdermin-D和p53在LPS诱导的衰老和焦亡中的作用。TP53和GSDMD基因敲除显著降低了LPS依赖性细胞生长停滞，以及p53和p21^CIP1的诱导(图1H, I, J)。在LPS诱导的衰老过程中，GSDMD的下调对p16^INK4a和caspase-4的诱导产生了强烈的影响(图1J)。这些结果表明，由非典型炎症体感应的细胞质LPS诱导了依赖于caspase-4、gasdermin-D和p53表达的衰老反应。

图1 LPS介导的caspase-4活化诱导人原代成纤维细胞衰老表型

2. caspase-4介导的LPS诱导的衰老反应与IL-1β启动无关

IMR90成纤维细胞中唯一过表达CASP4或CASP1的衰老诱导并没有诱导IL1B的转录激活(图2A)。相比之下，IL1B转录水平在LPS转染后以caspase-4依赖的方式增加(图2B)。作者之前已经证明TLR2在细胞衰老中控制IL1B表达和SASP的作用。因此，进一步研究TLR2介导的炎性小体启动是否与LPS介导的caspase-4诱导的衰老协同作用。用TLR2激动剂Pam2CKS4启动炎症小体与LPS转染显著协同，以产生强大的IL-1β诱导，并且这种诱导通过CASP4异位过度表达进一步增强(图2C)。然而，通过添加Pam2CKS4，没有观察到LPS诱导的衰老中细胞增殖或SA-β-半乳糖苷酶诱导的显著减少(图2D, E)。然而，与OIS中观察到的对数增长相比，在所有条件下，LPS转染细胞中观察到的IL1B mRNA水平的增加都是最小的(图2C)。这些结果表明，在LPS介导的细胞衰老过程中，caspase-4刺激的额外信号，如持续启动信号，对于IL1B和SASP的强烈诱导是必要的。此外，这些数据表明LPS诱导的caspase-4衰老反应是独立于IL1B和SASP的。

图2 LPS介导的caspase-4诱导的衰老不依赖于炎性小体启动

3． caspase-4的蛋白水解活性对LPS诱导的衰老不是必需的

为了进一步研究caspase-4蛋白酶的蛋白酶活性对衰老的贡献，caspase-4野生型和催化死亡突变体C258A（CASP4^C258A）在IMR90细胞中过度表达(图3A)，并评估表型结果。野生型CASP4或CASP4^C258A的过度表达在类似程度上减少了细胞增殖并增加了SA-β-半乳糖苷酶活性(图3B, C)。LPS转染前，CASP4野生型和CASP4^C258A在IMR90成纤维细胞中稳定过表达(图3D)。在LPS转染后，表达CASP4^C258A而非CASP4野生型的IMR90细胞对细胞死亡具有抵抗力(图3E)，表明caspase-4缺陷型在细胞焦亡中起主要的负作用。然而，在LPS刺激后，CASP4野生型和CASP4^C258A过表达细胞对衰老特征的获得同样敏感(图3F)。这些结果表明，与caspase-4介导的细胞焦亡相反，caspase-4在LPS诱导的衰老中的作用与其催化活性无关。

图3 Caspase-4介导的衰老调控独立于其催化功能

4． 在癌基因诱导的衰老过程中，caspase-4非经典炎症体被诱导和组装

接下来，研究炎性caspase-4在癌基因诱导衰老(OIS)中的作用。为了诱导OIS, HRASG12V(以下简称RASG12V) 在IMR90人成纤维细胞中持续过度表达。RASG12V过表达降低了细胞增殖，增加了SA-β-半乳糖苷酶活性(图4A)。与细胞周期抑制剂p21CIP1、p16INK4a和p15INK4b的上调相一致，RASG12V过表达后，caspase-4在mRNA和蛋白质水平的表达均增加(图4B, C)。接下来，作者利用他们和其他人广泛使用的诱导系统来严格控制衰老的开始。在该系统中，雌激素受体(ER)配体结合域的突变形式与相关蛋白（RAS）融合；因此，在添加4-羟基三苯氧胺(4OHT)后，ER:RAS细胞发生OIS(图4D)。与未处理的IMR90 ER:RAS细胞相比，加入4OHT后，IMR90 ER:RAS细胞增殖停止，SA-β-半乳糖苷酶活性增加(图4D)。使用该系统的时间过程实验显示，在OIS处理的细胞中，CASP4 mRNA水平与IL1B mRNA表达呈指数增长并行增加(图4E, F)， caspase-4蛋白水平也呈指数增长(图4G)。4OHT处理后3天，在IMR90 ER:RAS衰老细胞中检测到内源性caspase-4寡聚，但在对照细胞中未检测到(图4H)。此外，在添加4OHT后4天和8天，IMR90 ER:RAS细胞中caspase-4蛋白水解活性也增加(图4I)。这些结果表明，在OIS中诱导了caspase-4的表达，并组装了非标准炎症小体。

图4 caspase-4非典型炎症小体在癌基因诱导的衰老中被激活

5． 在OIS中，caspase-4非典型炎症小体是炎症信号转导所必需的

接下来，在IMR90 ER:RAS系统中研究了caspase-4在OIS中的功能作用。IMR90 ER:STOP和ER:RAS细胞转染对照组和CASP4靶向小干扰RNA（siRNA），在加入4OHT后5天和8天收集样本，分别在caspase-4激活后和完全SASP形成后收集样本，并进行转录组分析(图5A)。差异表达基因分析发现，在CASP4敲除后，有557和478个基因显著差异表达(FDR 10%)，其中340个和240个基因分别在加入4OHT5天和8天后，在RASG12V-OIS细胞中以CASP4依赖方式诱导表达(图5A)。进行基因组富集分析(GSEA)显示，在加入4OHT5天和8天后，RASG12V-OIS细胞中与炎症过程(包括TNF-α信号和干扰素反应)相关的基因组存在CASP4依赖调节(图5B)。绘制炎症反应基因组中所有基因的对照组IMR90 ER:STOP和CASP4敲除与对照组IMR90 ER:RAS细胞的折叠变化值的热图，揭示了一种模式，通过该模式，如果以CASP4为靶点，包括SASP因子，在衰老过程中增加的炎症相关基因的表达被消除(图5C)。RT-qPCR验证IL1A和IL1B表达的变化(图5D, E)。当CASP4在OIS中被靶向时，SAA1和SAA2的表达也降低了(图5F, G)。此外，当CASP1或CASP4被靶向时，细胞内成熟IL-1β的水平也显著降低(图5H, I, J)。此外，当CASP4被靶向时，在RAS^G12V诱导的细胞培养条件培养液中，分泌IL-1β的浓度显著降低(图5K)。此外，用两个逆转录病毒shRNA载体抑制CASP4的表达也会影响OIS中IL1B、IL6和IL8 mRNA的诱导，增加了数据的特异性和稳健性(图5L)。总的来说，这些结果表明caspase-4参与了caspase-1介导的OIS中SASP的激活。

图5 Caspase-4激活调控促炎SASP

6． 在OIS中，caspase-4非典型炎症小体有助于抑制细胞增殖

在使用shRNA逆转录病毒载体的长期细胞生长试验中，casp4靶向siRNA转染显著挽救了早期细胞增殖停滞(图6A)，并增加了总细胞含量(图6B, C)。GSEA显示CASP4在RAS^G12V-OIS基因标记”G2M CHECKPOINT”和”E2F TARGET”中呈负性调控，CDKN2A (p16^INK4a-p14^ARF)和CDKN2B (p15^INK4b)位点的表达，而p21^CIP1没有表达(图5B、6D)。靶向CASP4降低了p16^INK4a的表达，挽救了pRb的磷酸化（图6E），并导致E2F靶基因水平的转录增加（图6F），这表明caspase-4通过控制OIS中p16^INK4a和p15^INK4b的表达来调节细胞增殖。这些结果表明，caspase-4有助于阻止细胞衰老过程中的增殖，最终影响pRb的磷酸化状态，从而导致E2F靶基因的转录抑制。

图6在OIS中Caspase-4有助于抑制细胞增殖

7． Caspase-11在体内细胞衰老过程中被诱导

在OIS模型中分析了caspase-4小鼠同源caspase-11的表达，在该模型中，Pdx-CRE条件表达Kras^G12D诱导小鼠胰腺中胰腺上皮内瘤变(PanIN)(图7A)。在野生型小鼠中，与周围胰腺腺泡细胞、较高级别的PanINs以及导管和腺泡细胞相比，低级别PanINs对caspase-11呈阳性染色(图7A)。PanIN中Ki-67染色的定量显示，caspase-11的表达仅限于具有低增殖指数的早期衰老病变(图7B)，表明caspase-11表达与低级别PanIN病变中的低细胞增殖相关。与野生型小鼠相比，nfkb1^-/-小鼠的肺中脂褐素积累增加(图7C)。在表达caspase-11的细胞中检测到类似的脂褐素积累增加(图7C)。此外，在野生型和nfkb1^-/-小鼠的小气道上皮细胞中发现了p21和caspase-11之间的相关性(图7D)，表明在小鼠加速衰老模型中，caspase-11与衰老标志物相关。老年小鼠(24个月)的肺泡细胞显示端粒相关DNA损伤反应foci数量增加(图7E)，这是组织中衰老细胞积累的标志，我们发现这与caspase-11的增加同时发生(图7F)。总之，这些结果支持非典型炎症小体促进体内衰老的模型。

图7 Caspase-11在体内衰老过程中的表达

主要结论：

细胞衰老是由非典型炎症小体的胞质LPS识别诱导的，并且这一途径在细胞对致癌应激的反应中是保守的。作者提出非经典炎症小体的操纵可以为针对SASP的seno-therapies提供新的理论基础，并诱导癌症和衰老中的细胞焦亡。