EZH2通过整合素β1-FAK激活TGFβ信号促进乳腺癌骨转移

乳腺癌是全世界女性中最常见的癌症。大约50-70%的乳腺癌晚期患者发生骨转移，导致骨骼相关事件，包括疼痛、病病性骨折、脊髓受压、高钙血症和其他并发症。在本研究中，作者探讨了骨转移的分子机制，可能为骨转移患者提供额外的治疗策略。本文于2022年5月发表于《Nature communications》, IF=12.121。

本文技术路线：

本文主要内容：

1. EZH2促进乳腺癌骨转移，EZH2甲基转移酶抑制剂不能阻止这一过程

为了探讨EZH2在乳腺癌骨转移中的作用，作者构建了EZH2敲除细胞系1566.shEZH2及其对照细胞系1566.shScr。与注射1566.shScr细胞的小鼠相比，注射1566.shEZH2的小鼠无骨转移生存期和总生存期更长(Fig. 1a)。 生物发光成像(BLI)、x射线成像和苏木精和伊红(H&E)染色均显示出相同的结果(Fig. 1b)。

使用CRISPR/CAS9系统，生成了ezh2敲除的MDA-MB-231细胞亚克隆(231.KO)及其对照克隆 (231.sgCtrl)。其中的231.KO#1与野生型EZH2(231.KO# 1.EZH2) 或pLenti对照载体(231.KO#1.pLenti)中稳定表达。231.KO# 1.EZH和231.KO#1.pLenti)分别注射到小鼠中，注射231.KO#1.EZH2的细胞用载体或GSK126处理，GSK126是一种有效的EZH2小分子甲基转移酶抑制剂，而对照组小鼠注射231.KO#1.pLenti治疗。结果表明，231.KO#1.EZH2组无骨转移生存率明显低于231.KO#1.pLenti组(Fig. 1c, d)。出乎意料的是，gsk126处理的231.KO#1.EZH2组无转移生存率与vehicle处理的231.KO#1.EZH2 组相似(Fig. 1c, d)。与对照组相比，注射1566.KO细胞的小鼠无转移生存期和总生存期均显著延长 (Fig. 1e,f)。对照细胞组小鼠在无骨转移生存期、总生存期方面，与EPZ-6438组之间没有显著差异(Fig. 1e, f）。在体外实验中，高表达ezh2的细胞比低表达ezh2的细胞具有更强的迁移和侵袭能力(Fig. 1g）。与对照231.KO#1相比，野生型EZH2的重表达(231.KO#1. ezh2)显著提高了细胞迁移和侵袭能力。此外，与注射231.KO#1.pLenti细胞的对照组相比，野生型EZH2的重表达(231.KO#1.EZH2)显著增加细胞迁移和侵袭(Fig. 1h)。

Fig1 EZH2促进乳腺癌骨转移，EZH2甲基转移酶抑制剂不能阻止这一过程

2.  EZH2调节乳腺癌骨转移的恶性循环

乳腺癌细胞与RAW264.7破骨前体细胞和MC3T3成骨细胞共培养(Fig. 2a)。共培养六天，与MDA-MB-231 和 231.sg对照细胞相比，sezh2基因敲除的231.KO # 1和231.KO#2细胞的生长明显受到抑制(Fig. 2b)。与EZH2敲除的细胞共培养时，与MDA-MB-231 和 231.sg对照细胞相比，成熟破骨细胞的前体破骨细胞RAW264.7明显减少（Fig. 2c)。与231.KO#1相比，231. ko # 1.H689A细胞重新表达H689A促进了肿瘤细胞增殖和破骨细胞成熟(Fig. 2d, e)。静脉注射231.KO#1.EZH2和231. ko # 1.H689A细胞转染小鼠，观察骨转移生长情况，发现231.KO#1.EZH2和231. KO # 1.H689A细胞诱导骨转移病变(Fig. 2f)。PTHLH是乳腺癌骨转移的介质。通过qRTPCR检测，在MDA-MB-231和4T1细胞中敲除EZH2可以降低TGFβ处理下的PTHLH mRNA表达, 而GSK126处理4T1细胞并没有降低Pthlh mRNA的表达(Fig. 2g, h).

Fig2 EZH2调节乳腺癌骨转移的恶性循环

3. FSP1EZH2在TGFβ刺激下增加pS465/467-Smad2和pY397-FAK水平

PTHLH是一个众所周知的TGFβ下游基因，受p-Smad2/Gli2转录因子复合体或p38 mapk7,23调控。为了进一步探索EZH2是如何促进乳腺癌细胞中PTHLH和TGFβ信号转导的，作者检测了乳腺癌细胞中pS465/467-Smad2和pT180/Y182-p38 MAPK水平。在TGFβ刺激下，MDA-MB-231细胞敲除EZH2可抑制pS465/467-Smad2水平，但Smad2、Smad3、Smad4蛋白水平没有显著变化(Fig. 3a)。与对照载体相比，H689A EZH2重表达也增加了pS465/467-Smad2的水平(Fig. 3b)。敲除ezh2基因后进行反向蛋白芯片分析，结果显示，显著下调和上调的蛋白为激酶，包括酪氨酸激酶(Fig. 3c)。值得注意的是，FAK上酪氨酸397的磷酸化水平(pY397-FAK)显著降低(Fig. 3c)。通过WB验证了RPPA数据，结果显示，在MDA-MB-231和MCF7细胞中敲除EZH2可以抑制TGFβ处理下的pY397-FAK和pS465/467-Smad2水平(Fig. 3d)。

为了检查pY397-FAK的增加是否与pS465/467-Smad2的增强有关，作者用不同浓度(1-10 μM)的FAK抑制剂(FAKi、VS-4718或VS-6063)，再经TGFβ处理(5 ng/ mL, 2 h) MDA-MB-231细胞，检测pS465/467-Smad2。结果发现FAKi降低了pS465/467-Smad2水平，甚至在TGFβ刺激下也降低了PTHLH mRNA的表达 (Fig. 3e)。此外，在MDA-MB-231细胞中使用shRNAs敲除FAK (shFAK#2或shFAK#3)也能抑制pS465/467-Smad2的水平(Fig. 3f)。

Fig3 EZH2在TGFβ刺激下增加pS465/467-Smad2和pY397-FAK水平

4. pY397-FAK诱导TGFβ ri酪氨酸磷酸化，增强其与TGFβ rii的结合，以响应TGFβ

在mda - mb - 231细胞中，评估FAK是否调控TGFβRI和TGFβRII的表达。发现无论有无TGFβ暴露，FAK IP均可降低TGFβRI，而非TGFβ RII (Fig. 4a)。此外，通过FAKi VS-4718处理阻断FAK激酶活性，降低了FAK与TGFβRI的结合(Fig. 4b)。TGFβRII的WB结果显示FAK抑制显著降低了TGFβRI与TGFβ RII的结合，以响应TGFβ的刺激(Fig. 4c)。此外，作者检测到TGFβRI上的酪氨酸磷酸化， FAKi VS-6063处理降低了酪氨酸磷酸化(Fig. 4d)。接下来，作者发现了一个未报道的酪氨酸182 (pY182)上的TGFβRI磷酸化位点，位于甘氨酸和丝氨酸残基富集区域(Fig. 4e)。

结构分析显示，TGFβRI的Y182位点高度暴露于潜在的磷酸化(Fig. 4f)，靠近TGFβRI的两个苏氨酸位点和一个丝氨酸位点(T185、T186、S187) (Fig. 4g)，它们被TGFβRII31和32结合并磷酸化。蛋白质对接结果表明，TGFβRI的Y182指向TGFβRII的K381（Fig 4g）。

Fig 4 pY397-FAK诱导TGFβ ri酪氨酸磷酸化，增强其与TGFβ rii的结合，以响应TGFβ

5. EZH2增加FAK上游ITGB1的表达

作者发现，敲除EZH2导致RNA Pol II与ITGB1(编码整合素β1)启动子的结合显著降低，而与ITGB3(编码整合素β3)的结合变化不大(Fig. 5a）。qRT-PCR显示敲低或敲除EZH2下调ITGB1 mRNA表达(Fig. 5b, c)。同时,ITGB1启动子驱动的荧光素酶报告基因检测显示，与与231.KO#1 和 231.KO#2相比，ezh2表达的MDA-MB-231 和 231.sgCtrl 细胞ITGB1启动子活性较高(Fig. 5d)。

ChIP-qPCR中，使用一系列的PCR引物结合到ITGB1启动子的不同区域，结果发现在MDA-MB-231细胞中，EZH2被招募到ITGB1启动子从P1到P5位点，预期在231.EZH2与ITGB1启动子位点的结合缺失（Fig. 5e）。在MDA-MB-231细胞中。EZH2敲除后，RNA Pol II与ITGB1启动子的结合也失去了(Fig. 5f)。类似地，在231.shEZH2#3 和231.shEZH2#4细胞中敲低EZH2能降低ITGB1启动子P1到P4位点的RNA Pol II结合(Fig. 5g)。

Fig5 EZH2增加FAK上游ITGB1表达

6.  临床适用的FAK抑制剂能阻断治疗ezh2诱导乳腺癌骨转移

使用BLI检测产生的骨转移生长，这证实了GSK126治疗没有阻止骨中的肿瘤生长. 令人兴奋的是，与对照组相比，FAKi VS-6063治疗显著阻碍了骨肿瘤的生长(P = 0.0442)(Fig 6a)。骨转移免疫组化染色显示FAKi VS-6063显著降低pS465/467-Smad2水平(P = 0.0066)和骨转移灶中PTHLH表达(P = 0.0074)，两种药物均有效抑制其靶点(Fig. 6b, c)。最后，作者检查了GSE2603数据集并验证了EZH2表达与乳腺癌患者无骨转移生存期呈负相关(r =−0.2394，P = 0.03) (Fig. 6d), 提示EZH2在原发性乳腺肿瘤中的高表达会导致患者发生骨转移的高风险。作者还研究了EZH2表达与下游效应因子的相关性，GSE14020数据集中乳腺癌患者骨转移组织中PTHLH的含量。作者发现骨转移患者中EZH2 mRNA表达与PTHLH mRNA表达呈正相关(Fig. 6e)

Fig6临床适用的FAK抑制剂治疗阻断ezh2诱导的乳腺癌骨转移

    综上所述，作者发现FAK是EZH2在乳腺癌骨转移恶性循环中的下游效应因子。发现FAKi联合标准的抗骨吸收药物、化疗或放疗可能为骨转移的乳腺癌患者提供额外的好处。