lncRNA NEAT1通过调节miR-362-3p/MIOX轴促进肝细胞癌铁死亡

lncRNA NEAT1参与调节细胞周期、增殖、凋亡和肿瘤细胞的迁移。然而，NEAT1在调节肿瘤中铁死亡中的功能和分子机制尚不清楚。在这里，我们发现铁死亡诱导剂erastin和RSL3通过促进p53与NEAT1启动子的结合来增加NEAT1的表达。诱导NEAT1通过竞争性结合miR-362-3p促进MIOX的表达。MIOX增加了ROS的产生，降低了细胞内NADPH和GSH的水平，导致erastin和RSL3诱导的铁死亡增强。重要的是，NEAT1的过表达通过增强体外和体内的铁死亡，提高了erastin和RSL3的抗肿瘤活性。总的来说，NEAT1通过调节miR-362-3p和MIOX在铁死亡中发挥了新的、不可或缺的作用。考虑到HCC患者对化疗和免疫治疗不敏感的临床发现，对于NEAT1高表达的HCC患者，诱导铁死亡可能是一种有希望的治疗策略。本文于2022年3月发表于Cell Death and Differentiation（IF=15.828）上。

技术路线

结果

1）铁死亡诱导NEAT1表达依赖于p53

为了鉴定与铁死亡有关的lncRNAs，用铁死亡诱导剂处理肝癌细胞系HepG2，用RNA-Seq进行转录组分析。如图所示，在erastin和RSL3处理后，40个lncRNAs导致两种处理的基因表达发生显著变化，以及分别受erastin或RSL3影响的125或123个lncRNAs（图1a、b）。我们根据差异表达基因列表挖掘了UALCAN数据库，发现了五种有趣的lncRNAs（NEAT1、C11orf95、DIO3OS、HCG18、SNHG12），它们在HCC中的表达与正常组织相比显著（图1c）。其中，NEAT1的表达显著高于其他lncRNAs（图1d）。因此，我们进一步研究NEAT1在铁死亡中的作用和机制。

NEAT1有两种亚型，NEAT1_1在大多数人体组织中组成性表达，而NEAT1_2的表达是组织特异性的。然而，NEAT1的生物学功能主要来源于NEAT1_2亚型。为了检测两种亚型的表达，我们设计了引物来产生两个扩增子，引物1检测到NEAT1_1和NEAT1_2的表达，引物2仅检测到NEAT1_2（图1e）。如图1f所示，在erastin和RSL3处理的HCC细胞中，这两种转录物均上调，表明NEAT1_1和NEAT1_2的表达在铁死亡中被诱导。另外，我们发现，p53的缺失消除了HepG2和HuH-7细胞中NEAT1的上调（图1g，h），表明erastin和RSL3诱导的NEAT1表达是由p53介导的。为了进一步测试p53是否直接调节NEAT1的转录，我们使用JASPAR程序分析了NEAT1的启动子区域，并发现了一个p53的结合序列。然后，我们进行ChIP分析，发现erastin和RSL3处理促进了p53与NEAT1启动子区域的结合（图1i）。此外，我们观察到在erastin或RSL3处理NEAT1-WT启动子后，启动子活性增加（图1j）。综上所述，在铁死亡诱导条件下，p53直接结合NEAT1的启动子并促进NEAT1的表达。

2）NEAT1促进erastin和RSL3诱导的铁死亡

为了研究NEAT1是否调节铁死亡，我们构建了两个NEAT1特异性shRNA。NEAT1 shRNA 1同时敲除NEAT1_1和NEAT1_2，而NEAT1 shRNA 2仅敲除NEAT1_2，而不影响NEAT1_1的表达（图2a、b）。接下来，我们建立了稳定表达两种不同NEAT1特异性shRNA的HepG2和HuH-7细胞系，并用erastin或RSL3处理它们。如图2c所示，在HepG2或HuH-7细胞中敲除NEAT1亚型或单独敲除NEAT1_2可显著抑制erastin和RSL3诱导的细胞死亡。NEAT1敲除显著抑制MDA、脂质ROS和Fe2+的积累（图2d、e、f）。总的来说，NEAT1促进erastin和RSL3诱导的肝癌细胞铁死亡。

3）NEAT1通过调节MIOX的表达来调节铁死亡

为了进一步阐明NEAT1在铁死亡中的作用机制，我们通过比较敲除NEAT1导致的基因表达差异来寻找NEAT1靶基因。如图3a和b所示，在转染shRNA对照的HepG2细胞中，经erastin处理后，有1953个上调基因和2098个下调基因。然而，在转染NEAT1 shRNA的HepG2细胞中，599个上调基因和711个下调基因对erastin无反应，表明这些基因在铁死亡中的修饰表达依赖于NEAT1（图3a，b）。此外，我们鉴定了6个上调基因和15个下调基因，它们具有更显著的修饰（图3c），并发现在erastin处理后，MIOX是上调最高的基因。同时，qRT-PCR检测表明，erastin和RSL3均不能诱导NEAT1敲除细胞中MIOX的上调，这进一步证实了铁死亡中MIOX表达的诱导依赖于NEAT1（图3d）。MIOX过表达拯救了由NEAT1缺乏抑制的erastin和RSL3诱导的铁死亡（图3e）。MIOX过表达增加NEAT1敲除细胞内MDA、脂质ROS和Fe2+水平（图3f-h）。总之，这些结果表明NEAT1通过调节MIOX的表达促进erastin和RSL3诱导的铁死亡。

4）MIOX通过调节Fe2+、GSH和NADPH促进铁死亡

先前的一项研究表明，MIOX过表达可通过调节铁积累、GSH活性和NADPH水平，加重顺铂诱导的急性肾损伤。为了测试这种机制在erastin和RSL3诱导的HCC细胞铁死亡中是否保守，我们在HCC细胞中过表达MIOX，并发现MIOX促进erastin和RSL3诱导的细胞死亡（图4a）。相反，敲低MIOX可抑制erastin和RSL3诱导的细胞死亡（图4e）。我们进一步检测了细胞内的Fe2+水平。如图4b所示，经过erastin和RSL3处理后，MIOX过表达的细胞内铁浓度显著升高。在用erastin治疗后，MIOX的过表达进一步降低了HepG2和HuH-7细胞中的GSH水平（图4c）。同样，NADPH有助于消除脂质ROS，并调节细胞对铁死亡的敏感性，在MIOX过表达的细胞中，NADPH也会降低（图4d）。相反，在HepG2和HuH-7细胞中，耗尽MIOX抑制了erastin诱导的HepG2和HuH-7细胞中Fe2+的积累、NADPH的降低和GSH的降低（图4f-h）。总之，MIOX通过调节细胞内的Fe2+、GSH和NADPH水平促进铁死亡（图4i）。

5）MiR-362-3p参与NEAT1对MIOX的调节

越来越多的证据表明，lncRNAs通过与miRNAs（如ceRNA）结合来调节靶基因。为了确定NEAT1在铁死亡期间是否作为ceRNA发挥作用，我们使用预测工具，使用starbase v2.0和DIANA-LncBase V2，在NEAT1中找到58个潜在的miRNA结合位点（图5a）。由于MIOX被证明是铁死亡中NEAT1的靶点，我们随后使用miRTarBase和targetscan在MIOX中寻找潜在的miRNA结合位点，两个数据库中都存在43个潜在的MIOX结合miRNA（图5b）。通过比较两种方法预测的miRNA，我们发现miR-362-3p是唯一重叠的miRNA（图5c），它可能通过NEAT1介导MIOX和铁死亡的调节。使用两种公开的生物信息学工具targetscan和starbase，我们发现NEAT1和MIOX的3′UTR包含假定的miR-362-3p结合位点（图5d）。接下来，我们进行荧光素酶活性测定（图5e）。如图5f 所示，在erastin或RSL3处理后，NEAT1的敲除增加了HepG2和HuH-7细胞中miR-362-3p的表达水平。相反，NEAT1的过表达降低了miR362-3p的表达水平（图5g）。miR-362-3p的过表达显著抑制野生型NEAT1的转录活性（图5h）。总之，这些结果表明NEAT1调节miR-362-3p。

为了确定MIOX是否是miR-362-3p的直接靶点，我们将miR-362-3p过表达载体与包含MIOX的3′UTR的报告载体共同转染。如图5i所示，miR-362-3p的过表达显著减弱了含有MIOX野生型3′UTR的报告载体的荧光素酶活性。相反，序列的突变阻断了miR-362-3p的抑制作用（图5i）。此外，我们发现miR-362-3p对MIOX 3’UTR活性的影响可以通过过表达的NEAT1部分恢复（图5i）。为了进一步证明miR-362-3p参与MIOX和NEAT1之间的交叉调节，我们评估了MIOX的表达。在erastin或RSL3处理的HepG2细胞中，NEAT1敲除抑制了MIOX的mRNA和蛋白质表达。相反，miR-362-3p的敲除显著增加了被NEAT1 shRNA抑制的MIOX的mRNA和蛋白质表达（图5j）。此外，野生型NEAT1的过表达增加了MIOX的mRNA和蛋白质表达。miR-362-3p的过表达显著抑制NEAT1诱导的MIOX的mRNA和蛋白质表达（图5k）。miRNA以Ago2依赖的方式抑制mRNA的翻译和降解。为了测试MIOX和miR-362-3p之间的相互作用是否受到NEAT1的影响，对NEAT1过表达或敲除的HepG2细胞进行RIP实验。如图5l所示，被Ago2-miR-362-3p复合物拉下的MIOX mRNA水平在NEAT1缺失的HepG2细胞中显著富集，而过表达NEAT1则显著降低MIOX mRNA水平（图5m）。总之，这些结果表明NEAT1通过miR-362-3p积极调节MIOX表达。

6）MiR-362-3p通过调节MIOX抑制铁死亡

为了分析miR-362-3p是否通过对MIOX的影响来调节铁死亡，我们通过过表达MIOX进行了拯救实验。转染miR-362-3p的HepG2细胞显著抑制erastin和RSL3诱导的细胞死亡，并降低MIOX的促进作用（图6a）。同时，过表达MIOX后，MDA、脂质ROS和Fe2+的积累也部分恢复（图6b-d）。此外，MIOX的过表达抑制了由miR-362-3p诱导的GSH和NADPH的细胞内水平（图6e，f）。转染miR-362-3p海绵的HepG2细胞显著促进了erastin-和RSL3-诱导的细胞死亡和相关的铁死亡，包括脂质ROS产生、铁积累、NADPH抑制和erastin诱导的GSH缺失(图6g-l)。MIOX的下调抑制了由miR-362-3p海绵促进的erastin-和RSL3诱导的铁死亡(图6g-l)。这些结果表明miR-362-3p通过调节MIOX的表达来调节铁死亡。

7）NEAT1过表达促进erastin或RSL3在体内外诱导的铁死亡

我们通过慢病毒载体在HepG2和HuH-7细胞中稳定地过表达NEAT1，用erastin或RSL3处理细胞，然后通过集落形成测定其对细胞活力的影响。我们发现NEAT1高表达水平的细胞对erastin和RSL3诱导的铁死亡细胞死亡更敏感（图7a ）。进一步探讨NEAT1表达水平对erastin或RSL3体内抗癌活性的影响。将NEAT1稳定过表达的HepG2和HuH-7细胞皮下注射到NU/NU裸鼠体内。NEAT1表达增加的肿瘤的大小明显小于使用相同药物治疗的对照组（图7b、c），并且表现出MDA水平升高和erastin诱导的GSH水平降低（图7d、e）。此外，在NEAT1过表达细胞中用erastin或RSL3处理后，4-HNE的染色显著增加（图7f）。同样地，在NEAT1过表达细胞中，MIOX表达显著升高。ISH染色证实，erastin或RSL3处理后，NEAT1过表达细胞中miR-362-3p的表达降低（图7f）。总之， NEAT1调节了erastin和RSL3在HCC细胞中的抗肿瘤活性。

结论：我们的研究结果概述了NEAT1在铁死亡中的关键作用及其调节机制，表明对于高表达NEAT1的肿瘤患者，诱导铁死亡可能是一种有前途的治疗策略。

参考文献：

Zhang Y, Luo M, Cui X, O'Connell D, Yang Y. Long noncoding RNA NEAT1 promotes ferroptosis by modulating the miR-362-3p/MIOX axis as a ceRNA. Cell Death Differ. 2022 Mar 25. doi: 10.1038/s41418-022-00970-9. Epub ahead of print. PMID: 35338333.