CircHGF抑制ONFH中BMSCs的细胞增殖和成骨分化

激素性股骨头坏死（ONFH）是一种常见的破坏性骨疾病。骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖能力和成骨分化在维持股骨头的结构和功能完整性以预防ONFH中起着关键作用。到目前为止，对ONFH进展过程中BMSCs分化障碍的潜在机制知之甚少。circRNAs被认为是重要的非编码RNAs，与各种人类疾病有关。然而，circRNA是否以及如何调节ONFH中BMSCs的增殖和成骨分化尚不清楚。在这项研究中，我们鉴定了182个差异表达的circRNA，其中108个circRNA上调。circHGF通过靶向miR-25-3p/SMAD7轴抑制ONFH中BMSCs的增殖和成骨分化。我们的发现为ONFH提供了潜在的诊断和治疗策略。本文于2022年3月发表在“Mol Ther Nucleic Acids”（IF=8.886）上。

技术路线

结果

1）ONFH-BMSCs中差异表达circRNA的鉴定

为了研究circRNAs在ONFH-BMSCs增殖和成骨分化中的潜在作用，我们首先筛选出ONFH-BMSCs中差异表达的circRNAs。微阵列分析结果表明，与对照组相比，ONFH-BMSCs组有182个差异表达的circRNAs，其中108个circRNAs上调，74个circRNAs下调。如层次聚类热图所示，两组之间的circRNAs表达模式是可区分的，其中大多数在ONFH BMSCs中上调（图1A）。两组归一化后的表达信号强度相对一致（图1B）。火山图显示了每个circRNA表达的折叠变化和p值（图1C）。Circos图显示了circRNAs在人类染色体上的分布，我们发现差异表达的circRNAs来自所有染色体（图1D）。

3）CircHGF被鉴定为ONFH相关的环状RNA

在circRNAs微阵列分析中，大多数差异表达的circRNAs被上调。考虑到富含miRNA结合位点的潜在功能，我们进一步研究了前20个上调的circRNA中最显著上调的circRNA hsa_circ_0080914。在circBase数据库中使用人类参考基因组GRCh37/hg19标注，hsa_circ_0080914由肝细胞生长因子(HGF)基因的第6 ~ 10外显子产生，位于chr7: 81346547-81374436（图3A）。我们称之为circRNA，circHGF，circHGF的剪接长度为780个核苷酸。PCR分析表明，发散引物在cDNA中扩增cirRNA circHGF，但在gDNA中不扩增cirRNA circHGF，收敛引物同时扩增circHGF和GAPDH（图3B）。如图3A（左）所示，Sanger测序证实circHGF具有环状结构。RT-qPCR分析验证了ONFH-BMSCs中hsa_circ_0080914的上调表达模式（图3C）。接下来，我们用circHGF过表达（OE）载体或以siRNA转染BMSCs，以调节其表达。结果证实，与阴性对照相比，转染circHGF OE载体的BMSCs中 circHGF表达水平显著上调(图3D)，而转染circHGF siRNA的BMSCs中 circHGF表达水平显著下调(图3E)。

4）CircHGF抑制ONFH中BMSCs的增殖和成骨分化

我们研究了circHGF对BMSCs增殖和成骨分化的影响。细胞周期分析表明circHGF下调明显增加了S期细胞的百分比，降低了G1期细胞的百分比（图4A），而circHGF OE降低了S期细胞的百分比，增加了G1期细胞的百分比（图4B）。上述结果表明，circHGF能抑制ONFH中BMSCs的增殖能力。通过western blot分析，我们发现在成骨诱导后，circHGF下调显著增强了BMSCs中成骨标记基因的表达，包括ALP、BMP2、RUNX2和OCN（图4C）。然而，circHGF-OE可明显抑制这些成骨标记基因的表达水平（图4D）。同时，在circHGF-siRNA转染后第7天和第14天，通过茜素红染色，我们发现与对照组相比，BMSCs的成骨分化显著增加（图4E），而OE-circHGF转染后第7天和第14天的茜素红染色结果表明，BMSCs的成骨分化明显减弱（图4F）。

5）MiR-25-3p促进BMSCs的增殖和成骨分化能力

考虑到miR-25-3p被starBase在线预测为circHGF的关键靶向miRNA，我们探讨了miR-25-3p在BMSCs中的表达模式和功能。首先，RT-qPCR分析表明，与对照组相比，ONFH-BMSCs中miR-25-3p的表达显著下调（图5A）。接下来，我们用miRNA mimics转染BMSCs以过表达miR-25-3p，或用miRNA抑制剂转染BMSCs以敲除miR-25-3p。RT-qPCR分析证实，miRNA mimics治疗后，miR-25-3p表达水平明显升高（图5B），而miRNA抑制剂治疗后，miR-25-3p表达水平降低（图5C）。然后，通过细胞周期分析，我们发现miR-25-3p mimics显著增加了S期细胞的百分比，降低了G1期细胞的百分比（图5D）。相反，miR-25-3p抑制剂处理降低了S期细胞的百分比，增加了G1期细胞的百分比（图5E）。这些结果表明，miR-25-3p可以促进ONFH中BMSCs的增殖能力。western blot分析表明，在成骨诱导后，miR-25-3p mimics明显增加了BMSCs中成骨标记基因（ALP、BMP2、RUNX2和OCN）的蛋白表达水平（图5F）。相反，miR-25-3p抑制剂对BMSCs产生相反的作用（图5G）。同时，在第7天和第14天使用茜素红染色，我们发现，在miR-25-3p mimics组中，BMSCs的成骨分化能力显著增强（图5H），而在miR-25-3p抑制剂组中，BMSCs的成骨分化能力显著降低（图5I）。

6）MiR-25-3p通过靶向SMAD7增强BMSCs的增殖和成骨分化

据报道，SMAD7在BMSCs和ONFH的成骨分化中起着关键作用。使用TargetScan 7在线工具和miRDB在线数据库，我们发现SMAD7是miR-25-3p的直接靶基因。接下来，我们探讨了BMSCs中miR-25-3p和SMAD7之间的作用。western blot分析表明，miR-25-3p可以明显抑制BMSCs中SMAD7的表达（图6A）。接下来，进一步使用OE-SMAD7研究SMAD7的关键作用，并通过western blot分析验证SMAD7的表达（图6B）。细胞周期分析表明，miR-25-3p增加了BMSCs的细胞增殖，这种效应可被SMAD7部分抵消（图6C）。通过western blot分析，我们发现，SMAD7也可以部分抵消miR-25-3p在BMSCs成骨分化中的作用（图6D）。结果提示miR-25-3p通过与SMAD7相互作用，促进BMSCs的增殖和成骨分化。

7）CircHGF通过靶向miR-25-3p/SMAD7轴在BMSCs中发挥作用

基于以上结果，我们接下来探讨了circHGF是否通过与miR-25-3p/SMAD7轴在BMSCs中发挥作用。通过细胞周期分析，我们发现circHGF敲除引起的BMSCs细胞增殖增强可被miR-25-3p抑制剂抵消（图7A）。western blot分析表明，miR-25-3p抑制剂可以抵消circHGF siRNA对BMSCs成骨分化能力的影响（图7B）。我们发现SMAD7 OE治疗显著抵消了circHGF siRNA对BMSCs增殖和成骨分化能力的影响（图7C和7D）。此外，进一步的实验表明，miR-25-3p mimics或SMAD7 siRNA都可以明显抵消circHGF OE对BMSCs细胞增殖和成骨分化能力的影响（补充图，未展示）。这些结果表明，circHGF通过靶向miR-25-3p /SMAD7轴发挥其功能。

8）CircHGF可直接与miR-25-3p相互作用，miR-25-3p可直接靶向SMAD7 3’UTR

我们进行了荧光素酶报告基因分析，以验证circHGF和SMAD7与miR-25-3p的结合位点（图8A和8B）。正如预期的那样，miR-25-3p显著抑制WT-circHGF 报告基因的荧光素酶活性，而miR-25-3p mimics和对照组之间的MUT circHGF 报告基因活性没有显著差异（图8C）。同样，miR-25-3p显著抑制WT-SMAD7 3’UTR报告基因的荧光素酶活性，而miR-25-3p mimics和对照组之间的MUT-SMAD7 3’UTR报告基因活性没有显著差异（图8D）。此外，荧光素酶活性测定显示，miR-25-3p显著抑制WT-SMAD7 3’UTR荧光素酶活性，而circHGF可部分逆转这种抑制作用（图8E）。这些结果表明，circHGF可以直接与miR-25-3p相互作用，miR-25-3p可以直接靶向SMAD7 3’UTR。

结论：我们成功绘制了激素诱导的ONFH中BMSCs的circRNAs表达谱，并鉴定了一种新的关键circRNA，称为circHGF，并揭示了circHGF通过与miR-25-3p相互作用调控SMAD7抑制ONFH中BMSCs的增殖和成骨分化。总之，本研究表明，靶向miR-25-3p/SMAD7轴的circHGF可能为治疗激素诱导的ONFH提供一种新的诊断和治疗策略。

参考文献：Feng X, Xiang Q, Jia J, Guo T, Liao Z, Yang S, Cai X, Liu X. CircHGF suppressed cell proliferation and osteogenic differentiation of BMSCs in ONFH via inhibiting miR-25-3p binding to SMAD7. Mol Ther Nucleic Acids. 2022 Mar 1;28:99-113. doi: 10.1016/j.omtn.2022.02.017.