FTO通过m6A-YTHDF2依赖性诱导PDGFC自分泌活性促进胰腺癌进展

m6A是一种新兴的mRNA修饰调节因子，在肿瘤发生中发挥着新的作用。尽管m6A修饰在病理和生理过程中都具有重要的功能意义，但其在胰腺导管癌（PDAC）中的作用仍不明确。在这里，我们发现FTO表达与PDAC患者的不良预后相关，并且抑制FTO表达抑制细胞增殖。此外，FTO直接靶向PDGFC，并以m6A-YTHDF2依赖的方式稳定其mRNA表达。PDGFC上调导致Akt信号通路重新激活，促进细胞生长。总之，我们的研究表明，FTO下调导致PDGFC 3ʹUTR中m6A修饰增加，然后以m6A-YTHDF2依赖性方式调节其转录水平的降解，突出了PDAC治疗和预后预测的潜在治疗靶点。本文于2022年4月发表于“Oncogene”（IF=9.867）上。

技术路线

结果

1）FTO在PDAC中高表达，与不良预后相关

为了解释m6A在PDAC中的关键作用，我们通过m6A比色分析检测了10例新鲜人胰腺肿瘤组织及其相应正常组织中m6A的整体水平。初步观察发现，与相应的正常组织相比，PDAC组织中整体m6A丰度显著降低（图1A）。然后，为了评估PDAC中主要m6A修饰酶的表达谱，我们分析了TCGA、GTEx、GSE15471和GSE62452的临床数据集，发现PDAC组织中FTO mRNA表达水平显著高于正常组织（图1B）。此外，我们验证了复旦大学上海癌症中心（FUSCC）队列中的生物信息学数据。对含有209名患者样本的组织微阵列（TMA）进行免疫组织化学（IHC）染色（图1C）。根据IHC评分，与正常组织相比，FTO在肿瘤组织中的表达水平更高（图1D）。Kaplan–Meier生存曲线显示，FTO高表达与PDAC患者预后不良相关（图1E）。最后，我们发现，与人胰腺导管上皮（HPDE）细胞相比，多个PDAC细胞系中FTO蛋白表达上调（图1F）。

2）沉默FTO抑制PDAC肿瘤生长

为了研究FTO在PDAC中的作用，用shFTO-a和shFTO-B转染PANC-1和MiaPaCa-2细胞。FTO敲除效应在mRNA和蛋白质表达水平均得到验证（图2A，B）。FTO敲除导致m6A水平增加（图2C）。FTO敲除显著降低PDAC细胞增殖（图2D），并降低集落形成效率（图2E）。同样，EdU染色分析表明，FTO敲除大大降低了EdU阳性细胞的百分比（图2F）。接下来，我们植入了一个皮下胰腺异种移植瘤，以进一步确定FTO在体内的致癌作用。将具有稳定FTO敲除（shFTO-B）的MiaPaCa-2细胞皮下注射到4周龄雌性BALB/c裸鼠体内（图3A）。与体外观察结果一致，FTO沉默组的肿瘤生长大小和重量明显低于对照组（图3B，C）。随后使用抗FTO抗体和增殖标记物Ki-67进行IHC染色，结果表明FTO敲除显著降低了shFTO组的Ki-67染色（图3D，E）。因此，FTO在促进PDAC肿瘤生长中起着关键作用。

3）通过m6A-Seq识别FTO下游靶点

为了确定PDAC中的FTO下游靶点，我们进行了甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）。主成分分析(PCA)显示，每个样本有3个重复聚类在一起，表明两组之间重现性良好(图4A)。在对照和FTO敲除细胞中，GGAC基序在m6A中高度富集(图4B)。根据m6A-seq的结果，我们进一步发现m6A峰主要富集在相邻的编码序列(CDS)和3’UTR(图4C)。我们进一步研究了MeRIP-seq表达数据，并探索了m6A和RNA水平均发生显著变化的峰值比例。事实上，在两组中检测到292个具有高甲基化m6A峰值以及mRNA表达降低的基因（图4D）。在这些差异表达基因（DEG）中，电压门控离子通道活性、信号转导和质膜是GO富集分析中最丰富的条目（图4E）。KEGG富集分析表明，PDAC中PI3K/Akt通路与FTO依赖转录相关（图4F）。为了验证这一发现，我们检测了Akt、P-Akt和P-GSK3β的表达（图4G）。FTO敲除显著降低了PANC-1和MiaPaCa-2细胞中这些基因的磷酸化水平。在MiaPaCa-2和PANC-1细胞中，scramble和FTO基因敲除组的PDGFC表达差异最大。最重要和有趣的是，在FTO敲低组中，一些下调的转录本表现出高甲基化的m6A修饰，包括PDGFC。我们关注PDGFC m6A峰，并发现其mRNA的3ʹUTR周围的富集在FTO敲除后增加（图4H）。因此，PDGFC被选为FTO介导的m6A 修饰的候选靶点。

4）FTO缺失以m6A-YTHDF2依赖的方式下调PDGFC mRNA水平

MiaPaCa-2和PANC-1细胞中的FTO敲除降低了PDGFC mRNA和蛋白质水平（图5A，B）。通过qRT-PCR（图5C），在异种移植物中也证实了类似的趋势。此外，与IgG RIP组相比，FTO敲除显著促进PDGFC mRNA中的m6A水平（图5D）。与对照细胞相比，FTO敲除细胞的荧光素酶活性显著降低。PDGFC-MUT2几乎消除了这种诱导，表明PDGFC表达的调节受FTO相关m6A修饰的控制（图5F）。由于YTHDF2作为主要m6A读取器的特异性，我们假设YTHDF2在PDGFC中的RNA识别和相互作用水平发挥作用。通过评估TCGA和GEO数据库，我们发现与正常组织相比，PDAC组织中的YTHDF2上调。事实上，通过RNA免疫沉淀（RIP）分析评估，YTHDF2与PDGFC有强烈的相互作用。当FTO被敲除时，PDGFC转录本中的YTHDF2富集显著减少（图5G）。此外，我们在FTO减少的MiaPaCa-2细胞中敲除了YTHDF2，并观察到胰腺细胞中PDGFC表达的部分恢复（图5H，I）。在FTO敲除条件下，YTHDF2敲除也消除了PDGFC mRNA减少的稳定性（图5J）。因此，我们的数据表明FTO以m6A-YTHDF2依赖的方式调节甲基化PDGFC mRNA水平。

5）PDGFC是一种促癌因子，与PDAC患者的FTO表达呈正相关

TCGA数据分析表明，PDGFC水平与PDAC患者的OS呈负相关，PDGFC和FTO水平之间呈显著正相关（图6A，B）。值得注意的是，较高的PDGFC水平与较差的OS显著相关(图6C)，并与FTO表达呈正相关(图6D)。此外，利用在TMAs上进行的IHC染色，我们进一步对PDGFC进行存活分析，并验证其在肿瘤和相邻正常组织之间的表达差异（图6F，H）。此外，如图6G所示，我们还生成了一个包含PDGFC和FTO的新IHC面板来预测PDAC的预后。Kaplan–Meier生存分析表明，两种标记物高表达的患者OS最短。

6）FTO介导的PDGFC激活与PDAC的肿瘤发生有关

为了确定PDGFC是否介导FTO在PDAC生长和进展中的作用，我们首先基于PDGFC的内源性表达将编码人PDGFC插入物的慢病毒载体转染到细胞中。我们发现PDGFC的过表达特别增加了PDAC细胞活力和集落形成，但也消除了FTO敲除条件下的下降（图7A-C）。接着，我们评估了胰腺癌细胞中Akt/GSK3β磷酸化、c-Myc和Cyclin D1的表达。FTO敲除降低了这些基因的表达，而PDGFC过表达挽救了这种趋势（图7D）。此外，为了进一步证实我们的假设，我们检测了Akt抑制剂（MK2206）是否可以消除PDGFC过表达细胞中这些基因的表达。在PDGFC过表达的细胞中，Akt/GSK3β磷酸化水平以及c-Myc和Cyclin D1表达上调，而在MK2206处理的细胞中，这些水平降低（图7E）。

7）FTO诱导PDGFC自分泌活性并与PDAC细胞增殖相关

我们在FTO稳定的敲除细胞中过表达PDGFC，并使用ELISA检测PDAC细胞分泌PDGFC的内源性水平（图8A）。正如预期的那样，稳定敲除FTO后PDAC细胞释放的PDGFC减少，过表达后PDGFC恢复。FB23-2是一种直接与FTO结合并选择性抑制FTO m6A去甲基酶活性的抑制剂，它确实抑制PDAC细胞中PDGFC的分泌（图8B）。CCK-8分析表明，CFPAC-1和MiaPaCa2细胞中FTO的过表达增强了细胞的增殖和活力，而FTO的过表达与PDGFR抑制剂的结合显示出更强的抑制作用（图8C，D）。此外，对在DMEM（全培养基）中培养的FTO scramble和敲除细胞进行CCK8分析，无论是否用重组人PDGFC（10 ng /ml）处理，也证明了外源性PDGFC的刺激增殖活性（图8E）。为了进一步阐明PDGFC诱导的信号通路，我们用重组人PDGFC（10 ng/ml）处理MiaPaCa-2细胞。值得注意的是，48小时的重组人PDGFC预处理可在scramble和FTO敲除条件下诱导Akt/GSK3β激活的磷酸化水平（图8F）。总之，这些结果表明，自分泌内源性和外源性重组人PDGFC可促进PDAC细胞的生长，其部分由Akt/GSK3β信号驱动。

结论：我们的研究揭示了胰腺癌中m6A甲基化水平的降低是由FTO的失调引起的。FTO和PDGFC的联合可作为预后工具和治疗反应标志物。FTO/PDGFC/PDGFR治疗靶点的潜力可用于开发有效治疗PDAC的治疗方案。这些发现为m6A修饰调控PDAC肿瘤发生的分子机制提供了新的见解。

参考文献：

Tan Z, Shi S, Xu J, Liu X, Lei Y, Zhang B, Hua J, Meng Q, Wang W, Yu X, Liang C. RNA N6-methyladenosine demethylase FTO promotes pancreatic cancer progression by inducing the autocrine activity of PDGFC in an m6A-YTHDF2-dependent manner. Oncogene. 2022 May;41(20):2860-2872. doi: 10.1038/s41388-022-02306-w.