17分生信-免疫来源的lncRNA signature

长链非编码RNA （lncRNAs）最近被认为与结直肠癌（CRC）的免疫修饰有关。然而，与免疫相关的lncRNAs的临床意义在很大程度上仍未被探索。目前，有研究构建一个免疫来源的lncRNA signature（IRLS）来改善个体结直肠癌患者的临床结果，该研究于2022年12月发表在《Nature communications》，IF：17.694。

技术路线：

主要研究结果：

1. 免疫浸润共识簇的开发和验证

该研究的总体设计如图1所示。根据单样本基因集富集分析（ssGSEA）评估的28个免疫细胞浸润，进行了共识聚类分析，其中所有CRC样本最初被分为k （k = 2.9）个聚类。一致性得分矩阵和模糊聚类（PAC）统计量的累积分布函数（CDF）曲线表明，当k = 2时，得到最优数量（图1A、B）。两个共识簇（C1和C2）显示了免疫浸润的显著差异，C2的总体浸润度明显高于C1（图1C、D）。因此，将C1定义为免疫冷肿瘤，C2定义为免疫热肿瘤。为了确保分析算法不影响两个共识聚类，使用TIMER、quanTIseq、MCP-counter、xCell、EPIC和ESTIMATE等6种算法来验证ssGSEA结果的稳定性和稳定性（图1E）。

图1两种算法识别免疫相关lncRNA

2. 鉴定来自免疫浸润模式的lncRNA模块

加权相关网络分析（WGCNA）过程中，将软阈值β设为9（no scale R2 R2 = 0.910），然后，12个模块被识别，以不同的颜色表示。在模块-性状关系中，黄色模块与免疫簇之间的相关性最高（图1F）。在黄色模块中，基因显著性（GS）与模块隶属度（MM）的相关系数达到0.96，说明lncRNA模块构建质量较优（图1G）。为了鉴定来自黄色模块内免疫浸润模式的hub lncRNA， 526个lncRNAs GS > 0.5和MM > 0.6被认为是hub免疫相关lncRNA （图1 G）。

3. 免疫相关lncRNA产生于ImmLnc途径

ImmLnc系统地从lncRNA和基因表达谱中推断出免疫相关通路活性的候选lncRNA调控因子。一种假设是，如果一个特定的lncRNA在免疫调节中发挥关键作用，那么其相关基因应该富集在免疫相关通路的顶部或底部。通过ImmLnc管道，鉴定出了791个与免疫相关的lncRNA （补充数据1）。大量的lncRNA与细胞因子受体、TCR信号通路、趋化因子受体、自然杀伤细胞的细胞毒性以及抗原加工递呈通路相关（图1H）。将WGCNA结果进行交集，共提取出235个重叠lncRNA进行后续分析（图1I）。

4.综合构建一种共识特征

基于235个免疫相关lncRNA的表达谱，单因素Cox分析鉴定出43个预后相关lncRNA。对这43个lncRNA进行了基于机器学习的整合程序，以形成一致的免疫相关lncRNA特征（IRLS）。在TCGA-CRC数据集中，通过LOOCV框架拟合了101种预测模型，并进一步计算了所有验证数据集中每个模型的C-index（图2A）。最优模型是Lasso和stepwise Cox （direction = both）的组合，平均c指数最高（0.696），该组合模型在所有验证数据集中c指数领先（图2A）。在Lasso回归中，当基于LOOCV框架的偏似然偏差达到最小值时获得最佳λ（图2B）。对Lasso系数不为零的30个lncRNA进行了stepwise Cox比例风险回归，最终确定了16个lncRNA （图2C）。

接下来，通过Cox模型中16个lncRNA的回归系数加权，计算每个患者的风险评分（图2C）。所有患者根据调查包确定的最佳临界值被分为高危组和低危组。如图2D-J所示，在TCGA-CRC训练数据集和6个验证数据集中，相对于低风险组，高危组患者的总生存期（OS）明显较低（均P < 0.05）。合并所有样本的元队列也显示出同样的趋势（P < 0.05）（图2K）。

图2通过基于机器学习的集成程序开发并验证了一个共识IRLS

5. IRLS模型的评估

ROC分析测定了IRLS的鉴别度 （图3A，B）。比较IRLS与其他临床和分子变量在预测预后方面的表现。如图3C所示，IRLS的准确性明显优于年龄等其他变量：性别、T、N、M、TMB；NAL；microsatellite state；ACT；TP53、KRAS或BRAF突变（P < 0.05，除GSE29621中IRLS与AJCC期比较外）。这些结果推测出IRLS和AJCC分期的结合可能会进一步提高该模型的预测能力。

图3 IRLS模型的评估

6. 基于基因表达的CRC预后标志的比较

为了比较IRLS与其他预后特征的性能，作者全面检索了已发布的预后特征。由于GPL570注释的验证数据集中严重缺乏miRNA信息，miRNA签名被排除。最终，纳入了109个signatures （包括mRNA和lncRNA signatures）。这些signatures与各种生物学过程相关，如免疫应答、自噬、ferroptosis、干性、上皮间充质转化、toll样受体信号转导、缺氧、糖酵解、脂肪生成、维生素D、表观遗传学、n6 -甲基腺苷、衰老、WNT和药物敏感性。在所有数据集上对每个signatures进行单变量Cox回归，观察到在所有队列中只有作者的模型与预后显著相关（图4A），这证明了IRLS的稳定性。此外，将IRLS的c指数与其他signature进行比较：IRLS在每个数据集上的表现都优于几乎所有模型（图4B）。大多数模型在自己的训练数据集和少数外部数据集（如Chen-Gene， Dai-FIG）中表现良好，但在其他数据集中表现较弱（图4B）。这可能是由于过拟合所得模型的泛化性较差所致。我们的signature通过两种机器学习算法进行了降维，因此具有更好的外推潜力。

图4 CRC中基于基因表达的预后标志比较

7. 在临床内部队列中验证

为了进一步验证IRLS模型在临床中的性能，下一步通过qRT-PCR分析评估了232例CRC患者的临床队列中这些lncRNAs的表达。Kaplan-Meier分析一致表明，高IRLS患者的OS和RFS显著较差（P < 0.0001）（图5A， B）。在对混杂变量（包括年龄、性别、T分期、N分期、M分期、AJCC分期、microsatellite state、化疗、ICI治疗）进行控制后，IRLS模型对OS而非RFS仍具有统计学意义（图5C、D），这与上述结果一致。ROC分析显示IRLS具有更高的准确性：预测1、3和5年OS的AUC分别为0.840、0.776和0.818（图5E）。同样，c指数达到0.765 （95% CI = 0.691 0.839）。此外，比较了IRLS与其他临床特征的预测优势，观察到IRLS保持最佳性能（图5F）。总之，一项临床内部队列研究的结果支持我们的发现，验证并证实了IRLS模型是相当稳健的，可以作为CRC预后的独立预测因素。

图5临床内部队列验证

8. 基于氟尿嘧啶的ACT和贝伐珠单抗受益的预测价值

越来越多的证据表明，lncRNAs与基于氟尿嘧啶的ACT和贝伐珠单抗的敏感性和耐药性有关。在此，进一步评估了IRLS对量化基于氟尿嘧啶的ACT和贝伐珠单抗疗效的预测价值。作者发现，在GSE19860、GSE28702、GSE45404、GSE69657和GSE72970中，有应答者的IRLS评分明显高于无应答者（P均< 0.05）（图6A-E）。应答者在GSE62080中有更高的IRLS趋势，但这并不显著（图6F），这可能与样本量小有关（n = 21）。ROC分析显示，IRLS可以准确预测基于氟尿嘧啶的ACT的疗效，其AUC值较高的有GSE19860（0.843）、GSE28702（0.778）、GSE45404（0.693）、GSE69657（0.765）、GSE72970（0.709）和GSE62080（0.722）（图6G-L）。同样，应答组的IRLS也更高（图6M），RLS也可以明显区分氟尿嘧啶ACT的应答者和无应答者（AUC = 0.854）（图6N）。

与单独使用基于氟尿嘧啶的ACT相比，对贝伐珠单抗敏感的患者在GSE19860 （P = 0.075）、GSE19862 （P = 0.112）和GSE72970 （P = 0.011）中表现出较低的IRLS水平（图6O-Q）。在三个独立数据集中，预测贝伐珠单抗疗效的IRLS的AUC分别为0.771、0.694和0.781（图6R-T）。这表明IRLS在贝伐珠单抗中也有良好的表现。综合来看，IRLS高的患者往往对氟尿嘧啶ACT敏感，对贝伐珠单抗耐药，而IRLS低的患者往往对贝伐珠单抗敏感，对氟尿嘧啶ACT耐药。

图6基于氟尿嘧啶的ACT和贝伐珠单抗疗效的预测价值

9. IRLS对ICI治疗的意义

细胞浸润分析显示，在TCGA-CRC和Meta-GEO队列中，IRLS与免疫浸润丰度呈显著负相关（图7A、B）。同样，IRLS和CD8A散点图在队列（r = 0.674，图7D）中显示出负相关。为了进一步验证CD8A蛋白在IRLS不同水平的表达，对石蜡切片进行了免疫组化。免疫组化图像和评分显示，低危组CD8A表达显著增高（图7E， F）。这表明低IRLS的患者可能拥有更多的ICI治疗后备资源。此外，IRLS也与TCGA-CRC中PD-L1的表达呈负相关（r = 0.612，图7G）和队列（r = 0.548，图7H）。在蛋白质水平上也发现了这一一致的发现（图7I， J）。IRLS能够准确预测TCGC-CRC中dMMR/M SI-H表型（AUC = 0.883）、Meta-GEO （AUC = 0.778）和内部队列（AUC = 0.794）（图7K M），这表明IRLS是microsatellite state评估的良好替代。ROC分析显示，IRLS也能明显区分派姆单抗的应答者和无应答者（AUC = 0.897），且明显优于PDL1 （AUC = 0.686， P<0.001）和CD8A （AUC = 0.725， P <0.01）表达（图7N）。

图7 IRLS对ICI治疗的意义

结论：

基于大量生物信息学和机器学习算法，作者开发了一个稳定而强大的signature，用于评估基于氟尿嘧啶的ACT、贝伐珠单抗和派姆单抗的预后、复发和益处。该IRLS模型是一个有前景的工具，可以优化单个CRC患者的决策和监测方案。

参考文献：

Liu Z, Liu L, Weng S, Guo C, Dang Q, Xu H, Wang L, Lu T, Zhang Y, Sun Z, Han X. Machine learning-based integration develops an immune-derived lncRNA signature for improving outcomes in colorectal cancer. Nat Commun. 2022;13(1):816. doi: 10.1038/s41467-022-28421-6