单细胞RNA测序揭示人类高级别浆液性卵巢癌的组织结构
高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的异质性没有得到很好的研究，这严重阻碍了HGSOC的临床治疗。因此，有必要描述HGSOC在其肿瘤微环境（TME）中的异质性。我们通过深度单细胞RNA测序(scRNA-seq)对早期或晚期HGSOC患者和非恶性卵巢样本进行分析。我们利用scRNA-seq对从HGSOC和非恶性卵巢组织中获得的59324个单细胞进行了测序。在这些细胞中，肿瘤细胞具有上皮-间充质转化（EMT）相关基因特征，其中NOTCH1、SNAI2、TGFBR1和WNT11的组合被进一步选择为预测HGSOC患者不良预后的基因。基质癌相关的成纤维细胞（mCAF）是HGSOC肿瘤中的优势CAF，在共培养系统中可以诱导卵巢癌细胞的EMT特性。特异性免疫细胞亚群，如C7-APOBEC3A M1巨噬细胞、CD8+TRM、TEX细胞，在早期肿瘤中优先富集。此外，免疫共抑制受体TIGIT 阻断可显著减少小鼠卵巢癌模型中的肿瘤生长。我们的研究结果主要应用于预测HGSOC患者预后的四种EMT基因模型、mCAFs增强卵巢癌细胞侵袭的能力以及抗TIGIT治疗的潜在治疗价值。本文于2022年6月发表在“Clinical Cancer Research”（IF=13.801）上。
技术路线
结果：
1）非恶性卵巢和原发性HGSOC肿瘤生态系统的单细胞分析
为了系统地研究HGSOC的肿瘤内异质性，我们对12例初治患者的单个卵巢细胞进行了深度scRNA-seq检测，其中包括7例HGSOC患者和5例年龄匹配的非恶性卵巢患者。按照标准程序，从这些样本中总共获得59324个细胞。其中，33264个细胞（56%）来自HGSOC肿瘤，26060个（44%）来自非恶性卵巢（图1A）。然后对这些细胞进行聚类，并根据建立的基因标记列表进行注释。使用UMAP方法对细胞进行可视化，如图1B所示。此外，图1C显示了生态系统细胞类型的识别，包括T细胞谱系、上皮细胞、单核细胞、内皮细胞类型、细胞周期细胞、成纤维细胞、B细胞和浆细胞类型以及平滑肌细胞/肌成纤维细胞。然后应用KEGG分析来揭示每个细胞子集的特征（图1D）。对于HGSOC肿瘤的上皮细胞，分析显示与铁死亡相关的基因富集。对于那些在非恶性卵巢组织中，我们的工作显示了卵巢类固醇生成的基因富集。接下来，我们将细胞簇与肿瘤特征相关联。随着肿瘤分期的延长，T细胞簇的比例降低（图1E）。
2）不同肿瘤阶段的生态系统上皮细胞特征
我们分析了肿瘤上皮细胞的特征。在所有组织中共收集14636个卵巢上皮细胞，并将其分为12个簇，包括8192个来自HGSOC肿瘤的细胞和6444个来自非恶性卵巢组织的细胞（图2A和B）。然后应用CytoTRACE预测这些上皮细胞的分化状态，并识别HGSOC中的静止干细胞（图2C）。为了更好地理解上皮细胞在肿瘤发展中的作用，将Monocle算法应用于恶性上皮细胞的拟时分析，以预测其发展轨迹。根据基因表达相似性聚集了11个细胞簇，并将其投射到一个拟时过程中，该过程被定义为HGSOC基本期、2期和3期肿瘤（图2D）。沿着轨迹，第3阶段簇1细胞的基因特征被描述为某些功能途径，包括focal adhesion、雌激素信号通路、PI3K-AKT信号通路、relaxin信号通路、凋亡和rap1信号通路（图2E）。为了检查EMT标记物与患者生存率的相关性，使用TCGA和GEO在线分析和可用的OS结果评估了TCGA HGSOC数据集、GEO HGSOC数据集和两个浆液性卵巢癌数据集。我们的分析表明，四个基因，包括NOTCH1、SNAI2、WNT11和TGFBR1在这四个批量表达数据集中的至少三个队列中与不良预后显著相关。值得注意的是，在所有这四个数据集中，这四个基因的组合与较差的OS相关（图2F）。此外，通过免疫荧光分析进一步验证了HGSOC组织中的其他EMT标记基因CDH1和VIM，结果表明，一组强大的细胞具有潜在的EMT功能（图2G）。
3）基质间充质干细胞的多样性和CAFs的特征
我们继续研究基质成纤维细胞的特征。在13201个成纤维细胞中，出现了14个细胞簇（图3A）。在许多非恶性卵巢特异性成纤维细胞中观察到间充质干细胞（MSC）的特性（图3A）。根据每个基因表达特征，将非恶性成纤维细胞分成三个亚群。MSC亚群1、2和3分别称为NT5E/THY1/ENG+MSCs、NT5E/ENG+MSC样细胞和ENG+MSC样细胞（图3A和B）。在恶性成纤维细胞中，具有强烈细胞外基质特征的mCAFs，如PTHLH、FGF1、WNT7B、WNT2和TGFB3，是HGSOC肿瘤中的主要CAFs（图3C）。除此之外，主要来自癌症患者6的mCAFs表现出显著高水平的MMP11、THRC1、POSTN、VCAN和COL10A1（图3D）。一致地，通过使用TCGA HGSOC数据进行生存分析，图3E一致显示了这些顶级标记基因的高表达与患者预后差之间的相关性。IF染色表明，晚期HGSOC的mCAFs对典型CAF标记a-SMA、波形蛋白和COL3A以及mCAF标记COL10A和MMP11呈阳性（图3F）。这些mCAFs具有一定的促EMT特性，表现为在CAF/卵巢癌细胞(A2780或OVCAR3) transwell共培养体系中，间充质生物标记物如ZEB1、波形蛋白和snail在蛋白质水平上的上调，肿瘤细胞侵袭能力的增加(图3G和H)。
4）M1巨噬细胞的富集表明HGSOC早期预后良好
我们通过MNN聚类方法将巨噬细胞簇重新排列为10个簇，以深入分析细胞特征（图4A）。进一步将这些簇的基因表达模式与M1、髓源性抑制细胞（MDSC）和M2巨噬细胞的经典表达模式进行比较（图4B）。我们的结果表明，C7-APOBEC3A细胞簇高度表达M1巨噬细胞相关基因，包括IFI6、ISG20、LY6E、IFIT3、CXCL10和IL1RN（图4B）。簇C0-OLFML3细胞具有所有三种巨噬细胞亚型特征，表明HGSOC肿瘤TME中M1、MDSC和M2巨噬细胞之间的动态转化（图4B）。然后在HGSOC组织中检测巨噬细胞与其他免疫细胞类型的相互作用能力。单核细胞、B细胞、T细胞和自然杀伤细胞的迁移程度在肿瘤晚期减弱，表明巨噬细胞失去了对其他免疫细胞的吸引力（图4C）。相反，许多代表巨噬细胞中生长因子分泌的基因在肿瘤晚期显著诱导（图4C）。簇C7-APOBEC3A细胞已显示M1巨噬细胞具有抗肿瘤活性（图4D）。图4E显示C7-APOBEC3A簇显示趋化因子的分泌增强，包括CCL8、CXCL10、CXCL11和TNFSF10。在C7-APOBEC3A巨噬细胞中观察到SAA1、APP、ANXA1和FPR2的诱导，这代表了巨噬细胞的激活(图4F)。C7-APOBEC3A簇的基因标记与较好的预后相关（图4G），而聚类C1-TCOF1与不良预后相关（图4H）。
5）CD8+T细胞在HGSOC和非恶性卵巢组织中的分类和功能注释
与非恶性组织相比，除了巨噬细胞外，HGSOC肿瘤中淋巴细胞的特征和分布也得到了表征。HGSOC和非恶性卵巢组织中存在浸润性淋巴细胞，通过IHC和IF证实（图5A）。由于T细胞系携带CD8A基因富集（图1C），我们通过CD8A抗体的IF分析证实了其在HGSOC肿瘤中的存在（图5B）。通过MNN聚类方法将CD8A+T细胞重组为九个簇（图5C），它们分布在不同的组织中（图5C）。例如，以CD8-C1-IFIT3为代表的组织驻留记忆CD8+T细胞（CD8+TRM细胞）更局限于肿瘤组织中。以CD8-C5-DNAJB1基因模式为特征的中央记忆CD8+T细胞（CD8+TCM细胞）主要来自非恶性卵巢细胞（图5C）。值得注意的是，耗竭T细胞（CD8+TEX细胞），以CD8-C0-CXCL13或CD8-C7TNFRSF4为标记，由肿瘤细胞填充。接下来，我们关注了在HGSOC组织中富集的两种细胞类型，包括CD8+TRM和CD8+TEX细胞。为了更好地了解CD8+TEX细胞在HGSOC中的作用，深入探讨了CD8+TEX细胞的基因表达模式。在这些标记中，CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、SIRPA和TIGIT是排名靠前的基因（图5D）。值得注意的是，共抑制受体TIGIT在HGSOC组织中高水平表达。图5E显示，CD8+TEX细胞的数量在第一阶段早期较高，但在晚期减少。有趣的是，PAGA拟时分析表明，耗尽T细胞（CD8+TEX细胞）的优先富集，也称为CD8+TRM CXCL13细胞，位于CD8+TRM和TEM细胞分化的末端（图5F）。
CD8+TRM细胞有助于早期HGSOC肿瘤的局部免疫保护。为了解释早期HGSOC肿瘤中CD8+TRM细胞是如何形成的，我们检查了生存因子的表达，如IL15、IL17和NOTCH配体，其中，IL15在HGSOC来源的恶性上皮细胞中表达，并诱导CD8+TRM细胞和CD8+TEX细胞的形成（图5G）。除上皮细胞外，HGSOC肿瘤中的M1巨噬细胞主要表达CXCL9和CXCL10，通过CXCL9/CXCL10-CXCR3相互作用招募CD8+TRM细胞（图5G）。我们还检测了CD8+TRM细胞的基因特征与患者生存率的相关性，并证明CD8+TRM细胞的特征与改善患者生存率显著相关（图5H）。总的来说，我们的发现有力地表明了早期HGSOC肿瘤中CD8+TRM/TEX细胞和上皮细胞以及巨噬细胞之间的潜在相互作用机制。
6）TIGIT阻断剂在卵巢癌发生中的作用
已知免疫共抑制受体TIGIT可调节抗肿瘤CD8+T细胞反应，在我们的研究中，其也在CD8+TEX细胞上高表达。接下来，我们测试了TIGIT阻断是否有助于卵巢癌的生长，将ID8细胞皮下注射到8只雌性C57BL/6小鼠体内。8周后，用抗TIGIT或同型匹配的对照抗体治疗ID8荷瘤小鼠（图6A）。正如预期的那样，抗TIGIT治疗的小鼠显示出减少的肿瘤负担（图6B），如肿瘤生长迟缓（图6C）、终点处较低的肿瘤体积和肿瘤重量（图6D和E）。TIGIT阻断显著抑制肿瘤中TIGIT+-CD8+T细胞的频率（图6F和G）。这些结果表明，抗TIGIT抗体对CD8+T细胞的TIGIT中和减轻了ID8荷瘤小鼠的肿瘤负担。
结论：我们详细描述了早期和晚期原发性HGSOC肿瘤的全面单细胞转录组图谱。利用拟时分析描述不同肿瘤分期的上皮细胞发育层次，并鉴定EMT的特性。此外，免疫共抑制受体TIGTI阻断剂可抑制ID8来源的C57BL/6小鼠模型的肿瘤生长。我们的研究报告了HGSOC独特的TME特性以及与肿瘤分期相关的肿瘤细胞特征，这将有助于开发新的治疗HGSOC的临床策略。
参考文献：
Xu J, Fang Y, Chen K, Li S, Tang S, Ren Y, Cen Y, Fei W, Zhang B, Shen Y, Lu W. Single-cell RNA sequencing reveals the tissue architecture in human high-grade serous ovarian cancer. Clin Cancer Res. 2022 Jun 8:clincanres.0296.2022-1-28 03:44:54.997. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-22-0296.