CircRNA在肿瘤研究中的经典实验设计思路 EWSR1诱导的circNEIL3通过稳定IGF2BP3促进胶质瘤进展和外泌体介导的巨噬细胞免疫抑制极化

作者通过分析环状RNA在胶质瘤组织中的表达谱，鉴定了一个来自NEIL3的环状RNA, hsa_circ_0001460，命名为circNEIL3，在体外和体内促进了胶质瘤的发生和进展。随后通过不同的通路，阐明circNEIL3促进胶质瘤进展的分子机制。该文章发表在《Molecular Cancer》，IF: 41.44。

技术路线：

主要研究结果：

1. CircNEIL3在胶质瘤组织中表达显著上调

作者首先分析了39个胶质瘤组织(11个GBM和28个低级别胶质瘤(LGG))和8个正常脑组织(NBTs)中环状RNA的表达谱。火山图显示，在GBM和LGG之间，以及LGG和NBTs之间，circRNA表达有系统性差异(图1A, B)，在胶质瘤组织中差异上调的环状RNA (Log2FC≥4, P adj≤0.05)，并鉴定出hsa_circ_0001460 (图1C)。与NBTs相比，CircNEIL3在胶质瘤组织中显著上调，且随着胶质瘤分级的增加其表达增加(图1D)。ROC曲线表示circNEIL3可预测胶质瘤患者不良预后(图1E)。通过UCSC基因组学研究所生物信息学网站，发现circNEIL3在NEIL3基因的第8外显子和第9外显子之间反接，长度为596 nt(图1)。使用发散引物扩增circNEIL3的后剪接位点，并通过Sanger测序确认(图1F)。凝胶电泳分析结果显示，circNEIL3只能从cDNA中扩增出来，而从cDNA和gDNA中可以扩增出线性形态(图1G)。此外， RNase R和放线菌素D的处理证实了circNEIL3比NEIL3更稳定(图1H, I)。核质分离实验和FISH分析显示，circNEIL3主要定位于细胞质(图1J, K)。综上所述，circNEIL3在胶质瘤组织中表达显著上调，且在GBM中表达最高，提示其参与了胶质瘤的发生和恶性进展。

图1 CircRNA在胶质瘤中的表达谱和circNEIL3的特征

2. CircNEIL3在体外和体内均可促进胶质瘤的发生

功能实验表明：下调circNEIL3显著抑制细胞增殖、迁移和侵袭，过表达circNEIL3显著促进这些细胞行为(图2A-D)。体内实验显示，circNEIL3下调可显著抑制肿瘤生长和侵袭，延长荷瘤小鼠的生存时间，而circNEIL3过表达则会产生相反的效果(图2E、F)。此外，切除的肿瘤切片免疫组化显示，circNEIL3敲低的肿瘤组织中Ki67和CD44的表达低于载体组，而circNEIL3过表达则相反(图2G)。综上所述，circNEIL3在调节肿瘤发生和胶质瘤进展方面具有重要的功能。

图2 CircNEIL3在体外和体内促进GBM细胞增殖和转移

3. EWSR1促进了circNEIL3在胶质瘤中的生物发生

利用CircInteractome数据库和starBase 3.0数据库在circNEIL3的上下行区域预测了EWSR1的三个结合位点，分别称为序列1、序列2和序列3(图3A)。随着胶质瘤级别的升高，EWSR1表达水平升高，高表达的患者预后较差(图3B)。此外，敲低EWSR1可以抑制GBM细胞的增殖、侵袭和迁移(图3C、D)。在circRNA转录组中，发现circNEIL3与EWSR1呈正相关(图3E)，而在EWSR敲低的U251和A172细胞中，circNEIL3的表达明显下降(图3F)。将U251和A172细胞置于缺氧条件下0 h、6 h、12 h和24 h，随着暴露时间的增加，EWSR1和circNEIL3的表达上调(图3G，h)。通过RIP-qPCR检测证实，EWSR1能与NEIL3 pre-mRNA序列1和序列3结合，且在缺氧条件下结合能力显著上调（图3I）。最后设计拯救实验， EWSR1过表达诱导U251和A172细胞增殖、迁移和侵袭增加，可通过下调circNEIL3来逆转（图3J-L）。

图3 EWSR1促进circNEIL3的生物发生

4. CircNEIL3在物理上与IGF2BP3相互作用，并抑制泛素/蛋白酶体介导的IGF2BP3降解

为了探索circNEIL3诱导GBM细胞进展的分子机制，首先进行了RNA下拉分析和质谱分析，以探索与circNEIL3结合的潜在蛋白。共鉴定出50个与circNEIL3相互作用的蛋白，其中不包括AGO2，排除了circNEIL3作为ceRNA的可能性。将质谱数据与CircInteractome数据库中预测的RBP进行交叉。发现circNEIL3与IGF2BP3蛋白结合(图4A)。RNA pull-down和RIP-qPCR进一步证实了circNEIL3与IGF2BP3的相互作用(图4B, C)。RNA fish -免疫荧光分析，发现circNEIL3与IGF2BP3在细胞质中共定位(图4D)。IGF2BP3由2个RNA识别基序(RMS)和4个KH结构域组成。因此，建立了6个flag标记的载体，并通过Western blot进行了确认，以测试哪个区域与circNEIL3相互作用(图4E, F)。RIP-qPCR检测显示，circNEIL3主要结合在KH3-4区域，表明这个结构域负责招募circNEIL3(图4G)。然后为了识别IGF2BP3结合的circNEIL3序列，设计了三个突变位点，最终观察到IGF2BP3与circNEIL3的第三个位点结合(图4H)。这些结果表明circNEIL3在细胞质中与IGF2BP3发生相互作用。

然而，circNEIL3并没有显著改变IGF2BP3的mRNA水平(图4I)，但显著促进IGF2BP3及其下游靶点CDK4/6、CD44和c-MYC的蛋白表达(图4J)，表明circNEIL3可能通过破坏IGF2BP3蛋白的稳定来调控胶质瘤的恶性进展。由于过表达circNEIL3可以提高IGF2BP3的蛋白表达水平，延长IGF2BP3的半衰期(图4K)，表明circNEIL3通过蛋白酶体活性调控IGF2BP3蛋白的稳定性。circNEIL3过表达降低了IGF2BP3的泛素化(图4L)。然后，通过Ubibrowser数据库鉴定出一个泛素化赖氨酸(K)残基(K450)，位于IGF2BP3的KH3结构域(图4N)。利用Uniport数据库预测了IGF2BP3的K450位点在6个物种中高度保守(图4N)，并将K450泛素化位点可视化(图4O)。然后，作者将预测位点从赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)，以确认其作为泛素化靶点的作用。免疫沉淀(IP)结果显示，与野生型IGF2BP3相比，K450突变显著降低了IGF2BP3的泛素化水平，且在表达突变体的细胞中，cirNEIL3过表达导致的泛素化增强也被抑制(图4M)，突显出K450是IGF2BP3的主要泛素化位点。这些结果表明，circNEIL3通过抑制泛素/蛋白酶体依赖的降解，增强IGF2BP3蛋白的稳定性，从而促进胶质瘤的恶性进展。

图4 CircNEIL3与IGF2BP3相互作用并抑制其泛素化

5. CircNEIL3通过抑制IGF2BP3蛋白HECTD4 -介导的泛素化

co-IP和质谱分析，发现属于E3泛素连接酶的HECD家族的蛋白HECTD4可以与IGF2BP3结合。细胞实验证明HECTD4可以抑制GBM细胞的增殖、侵袭和迁移(图5A, B)。免疫荧光实验，证实IGF2BP3与细胞质中的HECTD4共定位(图5C)。此外，在HECTD4敲除GBM细胞中，IGF2BP3蛋白水平显著升高(图5D)，而其泛素化水平明显降低(图5E)，这表明在胶质瘤中，HECTD4作为E3泛素连接酶通过泛素-蛋白酶体途径降解IGF2BP3。

过表达circNEIL3可以阻断IGF2BP3与HECTD4的结合(图5F)，这解释了circNEIL3是如何稳定IGF2BP3的。Co-IP实验观察到HECTD4结合在IGF2BP3的KH3-4结构域，这是circNEIL3与IGF2BP3相互作用的同一位点(图5G和图4G)。这些数据表明circNEIL3通过阻止HECTD4介导的泛素化而稳定IGF2BP3蛋白。

图5 CircNEIL3阻断IGF2BP3与HECTD4的结合

6. CircNEIL3促进胶质瘤中巨噬细胞的浸润

如图6A所示，与circNEIL3低表达组相比，circNEIL3高表达组TME细胞浸润更多，免疫评分和基质评分更高，肿瘤纯度更低。与circNEIL3低表达的胶质瘤相比，circNEIL3高表达的胶质瘤中巨噬细胞浸润明显增加。使用Transwell实验发现，与NC组相比，过表达circNEIL3的GBM细胞的条件培养基(CM)显著促进THP1分化的巨噬细胞迁移(图6B)，而来自circNEIL3敲低的GBM细胞的CM则显示相反的结果(图6C)。总之，circNEIL3过表达的肿瘤细胞可以驱使巨噬细胞浸润到胶质瘤微环境。

GSEA结果表明，与circNEIL3低样本相比，circNEIL3高样本中YAP1信号基因标记高度富集(图6D)。对TCGA胶质瘤标本进行IGF2BP3的检测也得到了同样的结果(图6E)。qRT-PCR实验验证了circNEIL3促进CCL2和LOX表达的结果(图6F)，而这种由circNEIL3过表达诱导的表达增强可以通过IGF2BP3敲低来拯救(图6G)。最后，circNEIL3可以增加GBM细胞中YAP1和LOX的蛋白表达(图6H)。过表达circNEIL3引起的表达增加也可以通过敲低IGF2BP3来消除(图6I)。总之，这些结果表明circneil3过表达的GBM细胞可能通过激活YAP1信号驱动巨噬细胞浸润到肿瘤相关的微环境。

图6 CircNEIL3促进胶质瘤内巨噬细胞浸润

7. CircNEIL3可通过hnRNPA2B1被包装成外泌体

circNEIL3下拉实验的质谱数据，发现circNEIL3可以与hnRNPA2B1结合，hnRNPA2B1被报道可以运输各种RNA进入外泌体。并且在GBM细胞中通过RIP和RNA下拉实验证实了circNEIL3和hnRNPA2B1之间的相互作用(图7A, B)。在hnRNPA2B1敲低的GBM细胞中，circNEIL3在细胞中表达上调，在外泌体中表达下调(图7C)。综上所述，这些结果表明，circNEIL3可以被hnRNPA2B1包装成外泌体。

8. 外泌体向TAMs传递circNEIL3，从而使TAMs通过稳定IGF2BP3获得免疫抑制特性

流式细胞术结果表明，circNEIL3过表达显著上调巨噬细胞激活标志物CD163(图7D)。随着circNEIL3在外泌体中的表达增加，巨噬细胞激活标志物、免疫抑制分子和SPP1（维持胶质瘤细胞存活并刺激血管生成）显著上调(图7E, F，图S11J)。总之，这些结果表明，外泌体可以将circNEIL3传递给TAMs，从而使它们获得血管生成和免疫抑制特性。为了阐明circNEIL3介导巨噬细胞免疫抑制特性的机制，通过RNA下拉和RIP实验发现，在THP1分化的巨噬细胞中，circNEIL3与IGF2BP3结合的位点与肿瘤细胞相同(图7G, H)。此外，在肿瘤细胞中观察到，在THP1分化的巨噬细胞中，circNEIL3增加了IGF2BP3蛋白的表达，抑制了IGF2BP3的泛素化(图7I, J)。因此，与GBM细胞一样，IGF2BP3可以作为circNEIL3在巨噬细胞中的下游效应因子，介导巨噬细胞向免疫抑制表型极化。western blot检测结果证实，在THP1分化的巨噬细胞中，过表达circNEIL3和IGF2BP3均能提高YAP1蛋白的表达，而敲除它们的结果则相反(图7K, L)。此外，敲除IGFB2P3可消除过表达circNEIL3对YAP1蛋白表达的增强(图7M)，表明circNEIL3通过稳定IGF2BP3蛋白来增强YAP1的表达，从而促进巨噬细胞的免疫抑制表型极化。为了进一步验证circNEIL3在体内对巨噬细胞免疫抑制极化的影响，将过表达cicrNEIL3的巨噬细胞或阴性对照载体与胶质瘤细胞共原位植入裸鼠大脑。与NC组相比，circNEIL3过表达组肿瘤生长加快，荷瘤小鼠的生存时间延长(图7N-P)。为了进一步证明circNEIL3通过IGF2BP3-YAP1轴发挥作用，在临床胶质瘤患者局部组织中进行了免疫荧光染色实验。这些结果表明，IGF2BP3可以作为circNEIL3在巨噬细胞中的下游效应因子，使巨噬细胞获得免疫抑制特性，从而促进胶质瘤的进展。

图7外泌体可将circNEIL3传递给TAMs，从而使其获得血管生成和免疫抑制特性

结论：

作者发现了一种在人脑胶质瘤组织中上调的新型环状RNA circNEIL3。随着胶质瘤分级的增加，受EWSR1调控的circNEIL3表达增加。在功能上， circNEIL3在体外和体内促进了胶质瘤的发生和进展。从机制上讲，circNEIL3通过阻止HECTD4介导的泛素化来稳定IGF2BP3，这是一种已知的致癌蛋白。此外，circNEIL3过表达的胶质瘤细胞可驱动巨噬细胞浸润至TME。最后，circNEIL3可通过hnRNPA2B1打包成外泌体，传递给浸润的TAMs，从而使其通过稳定IGF2BP3获得免疫抑制特性，进而促进胶质瘤的发生和恶性进展(图7Q)。这些研究结果表明，circNEIL3可能是一种新的预后生物标志物和有希望的胶质瘤治疗靶点。