食管癌的发生和转移的新靶点-circBCAR3

circRNAs已被证明有助于食管癌的进展。生物信息学分析预测circBCAR3在食管癌中存在差异表达。我们研究了circBCAR3在食管癌发生中的致癌作用和生物发生。circBCAR3在食管癌组织和细胞中高表达，体外缺氧使其表达增加。沉默circBCAR3可抑制食管癌细胞的增殖、迁移、侵袭和铁死亡，抑制小鼠体内肿瘤的生长和转移。缺氧诱导的食管癌细胞迁移和铁死亡的促进作用通过下调circBCAR3得以恢复。在机制上，剪接因子QKI促进circBCAR3的生物发生，通过与miR-27a-3p结合上调TNPO1，加速食管癌的发生。这些数据提示circBCAR3可能是食管癌治疗的一个潜在靶点。本文于2022年7月发表于“Molecular Cancer”（IF=41.444）上。

技术路线

结果

1）CircBCAR3在食管癌组织和细胞中表达上调

为了了解circBCAR3在食管癌中的表达情况，我们首先从GEO数据库中分析了circRNAs在食管癌中的表达情况。基于GSE150476和GSE112496数据集，有5个circRNAs在食管癌中存在差异表达(图1A)。为了探索缺氧条件下食管癌中这些异常circRNAs的表达是否会发生改变，我们检测了缺氧处理后EC109细胞中它们的表达水平。Hsa_circ_0007624在缺氧处理后被发现上调(图1B)。通过PCR证实hsa_circ_0007624 (circBCAR3)表达上调，结果显示circBCAR3在食管癌肿瘤样本和细胞系中表达明显升高(图1C, D)，BCAR3 pe-mRNA的2,3,4,5外显子反向拼接形成circBCAR3的闭环结构(图1E)。环状(circBCAR3)对RNase R的抗性更强，而线性形式(BCAR3 mRNA)显著衰减(图1F)。此外，经转录抑制剂放线菌素D处理后，circBCAR3的转录半衰期长于BCAR3 mRNA，这表明circBCAR3的稳定性高于BCAR3 mRNA(图1G)。circBCAR3由cDNA中的发散引物扩增，证实了环状BCAR3外显子的存在，并排除了反式剪接产物(图1H)。随后对EC109和KYSE150细胞进行了RNA-FISH检测，结果显示circBCAR3主要存在于食管癌细胞的细胞质中(图1I)。

2）CircBCAR3敲低可抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭

为了研究circBCAR3在食管癌发生发展中的作用，我们设计了两个shRNAs，在EC109和KYSE150细胞中有效地沉默circBCAR3(图2A)。CCK-8、克隆形成实验和EdU实验显示沉默的circBCAR3抑制了EC109和KYSE150细胞的活力和增殖(图2B-D)。创面愈合实验和transwell实验(包括迁移和侵袭)表明，下调circBCAR3抑制食管癌细胞的迁移和侵袭能力(图2E, F)。

3）CircBCAR3敲低可以抑制食管癌细胞铁死亡

进一步探讨了circBCAR3敲除对铁死亡的影响。如图3A-D所示，sh-circBCAR3降低了细胞内Fe2+、MDA、脂质ROS，并增加了GSH水平。透射电镜观察到sh-circBCAR3在食管癌细胞中减少铁死亡的典型形态变化(图3E)。如图3F所示，沉默circBCAR3后，GPX4蛋白水平升高。

4）CircBCAR3敲低逆转了缺氧对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭和铁死亡的影响

我们进行功能研究以评估circBCAR3是否介导缺氧诱导的食管癌细胞恶性行为的改变。结果表明，缺氧处理可显著促进食管癌细胞的增殖、迁移、侵袭和铁死亡。CircBCAR3敲除显著逆转了缺氧的这些效应(图4)。

5）沉默的circBCAR3在体内抑制食管癌的肿瘤生长和转移

为了研究circBCAR3在体内肿瘤生长和转移中的作用，我们通过注射稳定表达sh-nc和sh-circBCAR3的细胞建立小鼠食管异种移植瘤。结果表明，circBCAR3缺乏降低了小鼠食管肿瘤的体积和重量(图5A-C)。免疫组化染色结果表明，沉默的circBCAR3可降低增殖标志物ki67的表达。H&E染色结果显示，sh-nc组肿瘤细胞分布密集，细胞形态正常，而sh-circBCAR3组肿瘤细胞数量减少，细胞核缩小较多(图5D)。随后，我们建立了肿瘤转移模型，通过尾静脉注射食管癌细胞来监测肺转移。生物发光图像显示沉默的circBCAR3诱导小鼠的肿瘤抑制，这可以从生物发光强度的下降中得到证明(图5E)。与对照组相比，沉默circBCAR3抑制食管癌肺转移(图5F)。H&E染色结果进一步证实了这一趋势(图5G)。免疫组化染色显示，敲除circBCAR3可以抑制肺组织中波形蛋白、N-cadherin、MMP-2、MMP-9的表达，促进E-cadherin的表达(图5H)。这些数据表明，在体内，circBCAR3的下调可以减弱食管癌的生长和转移。

6）在食管癌细胞中circBCAR3负向调控miR-27a-3p

从ENCORI数据库中预测与circBCAR3结合的潜在miRNAs。我们关注miR-27a-3p是因为它的高排名。miR-27a-3p与circBCAR3的结合位点如图6A所示。荧光素酶实验结果显示，circBCAR3负调控野生型miR-27a-3p(图6B)。RIP实验显示，Ago2是miRNA机制的效应物，可以与miR-27a-3p和circBCAR3结合(图6C, D)。与对照组相比，在EC109和KYSE150细胞中转染circBCAR3 shRNAs可提高miR-27a-3p的表达水平，过表达circBCAR3可降低miR-27a-3p的表达水平(图6E)。此外，为了确定circBCAR3和miR-27a-3p在食管癌细胞中的亚细胞分布，我们进行了RNA-FISH实验，结果表明circBCAR3和miR-27a-3p均位于细胞质中(图6F)。

7）TNPO1在食管癌细胞中是miR-27a-3p的靶点

通过ENCORI数据库，确定TNPO1、GCC2、THRB和CASC3为miR-27a-3p的潜在靶点。miR-27a-3p导致EC109细胞中TNPO1表达降低(图7A)。与对照Het-1A细胞系相比，6个食管癌细胞中TNPO1显著上调(图7B)。我们还发现，GEPIA数据库中182个食管癌组织中TNPO1的表达高于286个邻近非肿瘤组织(图7C)。根据ENCORI数据库的预测，TNPO1 3’UTR与miR-27a-3p序列互补(图7D)。荧光素酶实验证实TNPO1是miR-27a-3p的直接靶点(图7E)。MiR-27a-3p模拟物能有效降低TNPO1的表达水平，而MiR-27a-3p抑制剂能显著增强TNPO1的表达水平(图7F)。缺氧可诱导食管癌细胞中TNPO1表达上调(图7G)。PCR结果显示，TNPO1在45个食管癌组织中显著高表达(图7H)。

8）TNPO1过表达挽救了沉默的circBCAR3介导的对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭和铁死亡的抑制

我们设计了TNPO1过表达载体，发现它有效地拯救了sh-circBCAR3对TNPO1表达的抑制作用(图8A)。EdU分析和集落形成实验表明，circBCAR3 shRNA降低了细胞活力和增殖，TNPO1过表达进一步提高了细胞活力和增殖(图8B-C)。Transwell迁移和侵袭实验表明，TNPO1过表达挽救了敲低circBCAR3对细胞迁移和侵袭能力的抑制作用(图8D)。图9显示，sh-circBCAR3对食管癌细胞铁死亡的抑制作用被TNPO1的过表达所拯救。

9）剪接因子QKI加速了circBCAR3的生物发生

为了确定circBCAR3形成的调控机制，我们针对MEX3A、MEX3B、QKI、ESRP1、ESRP2、NOVA1、NOVA2等剪接因子设计shRNAs，检测转染这些shRNAs后circBCAR3的表达。PCR分析结果显示，剪接因子QKI和ESRP1负向调控食管癌细胞中circBCAR3的表达，而其他剪接因子对circBCAR3的表达无明显影响(图10A)。接下来，我们揭示了circBCAR3形成BCAR3外显子的侧翼的5个QKI结合序列(图10B)。使用QKI抗体的RIP实验表明，QKI在a、b、e和f位点与BCAR3 pre-mRNA结合(图10C)。此外，QKI在我们收集的45个食管癌组织中表达上调(图10D)。QKI敲低可以抑制circBCAR3的表达，而对BCAR3 mRNA的表达没有影响(图10E)。这些发现表明，剪接因子QKI通过内含子中的结合位点加速了circBCAR3的生物发生。

10）缺氧诱导E2F7表达激活QKI转录

缺氧如何诱导circBCAR3表达升高尚不清楚。因此，我们使用RNA-seq来筛选异常基因，如热图和火山图所示(图11A, B)。富集分析显示E2F家族的基因被富集(图11C)。我们通过检索GEPIA数据库来探讨这些E2Fs在食管癌中的表达。有趣的是，我们发现E2F7在食管癌中显著高表达(图11D)。PCR分析证实，缺氧处理后EC109细胞中E2F7和QKI表达均上调(图11E)。由于E2F7是一个转录激活因子，我们推测E2F7可能调控QKI的转录。在QKI的启动子中，我们基于JASPR在线数据库发现了一个E2F7的潜在结合位点(图11F)。随后，我们将该结合位点的野生和突变形式亚克隆到pGL3载体中。结果表明，E2F7对携带野生结合位点的报告载体荧光素酶活性有促进作用，但对突变位点无促进作用(图11G)。此外，E2F7敲除降低了QKI mRNA的表达水平(图11H)。我们检索GEPIA数据库，在182个食管癌组织中检测这些关键分子的表达相关性，结果显示E2F7与QKI、E2F7与TNPO1、QKI与TNPO1表达正相关(图11I)。

结论：我们创新性地证明了circBCAR3在食管癌中的致癌作用。在分子水平上，剪接因子QKI促进circBCAR3的生物发生，通过与miR-27a-3p结合上调TNPO1，加速食管癌的发生。这些数据表明，circBCAR3可作为食管癌研究和治疗的潜在标志物。

参考文献：Xi Y, Shen Y, Wu D, Zhang J, Lin C, Wang L, Yu C, Yu B, Shen W. CircBCAR3 accelerates esophageal cancer tumorigenesis and metastasis via sponging miR-27a-3p. Mol Cancer. 2022 Jul 15;21(1):145. doi: 10.1186/s12943-022-01615-8.