教你用7张图发8分一区文章 RNA结合蛋白PCBP1通过稳定DKK1 mRNA和随后下调β-catenin抑制肺腺癌的进展

近日，有研究通过发现polyc -RNA结合蛋白1 （PCBP1）作为肿瘤抑制因子和RNA调节因子，在人类癌症中下调，从PCBP1出发揭示其在肺腺癌（LUAD）中的生物学功能。该研究发表在Journal of Translational Medicine》，IF：8.440。

技术路线：

主要研究结果：

1. PCBP1低表达预示肿瘤患者预后不良

PCBP1多在不同水平上参与基因表达调控，其中一些成员在肿瘤发生中起着重要作用。hnRNP家族在肿瘤组织中显著下调，而PCBP1在早期死亡组和长期生存组中表达差异最显著（图1A）。K-M生存曲线显示，在TCGA和GSE19188队列中，PCBP1低表达组的总生存期均明显较差（图1B）。此外，PCBP1在远处转移患者对应的IV期肿瘤组织中表达显著降低（图1C, D）。这些结果提示PCBP1在肺肿瘤发生中起重要作用。

接下来，分析PCBP1在LUAD中的表达及其对诊断的预测价值。免疫组化显示PCBP1在肺肿瘤组织中表达下降（图1E, F）。PCBP1与肿瘤侵袭、淋巴结转移和临床分期显著相关（图1F）。作者比较了肺腺癌正常组织和肿瘤组织，发现PCBP1 mRNA水平在肿瘤中较低（图1G）。此外，PCBP1与三个病理参数在mRNA水平上有更显著的相关性（图1G）。PCBP1在蛋白和mRNA水平的低表达与LUAD患者的低生存率密切相关（图1H, I）。综上所述，这些数据表明PCBP1是LUAD患者潜在的预后生物标志物。

图1 PCBP1的预后和潜在生物学价值的鉴定

2. PCBP1在体外可抑制LUAD细胞的增殖和迁移

接下来，探讨PCBP1在LUAD进展中的作用。采用集落形成和CCK-8实验评估PCBP1对细胞增殖的影响：PCBP1敲低显著增加了A549和H358细胞的集落形成（图2A, B）和细胞增殖。Sh-PCBP1细胞的细胞增殖率增加（图2D，E），PCBP1过表达抑制细胞增殖（图2F）。创面愈合实验表明，与对照组细胞相比，sh-PCBP1细胞具有更高的细胞迁移能力（图2G、H），而这些指标在过表达PCBP1的细胞中降低（图2I）。综上， PCBP1可以抑制肺腺癌的发展。

图2 PCBP1对LUAD体外生物学行为的影响

3. PCBP1与肺腺癌患者的肿瘤转移相关

为了了解PCBP1影响LUAD存活的分子基础，在PCBP1缺失后对A549细胞进行了RNA测序。与对照组相比，sh-PCBP1中有643个下调基因和490个上调基因（图3A）。为了进一步研究已鉴定的DEGs的特征，采用基因肿瘤学和KEGG通路富集方法对交叉的差异基因进行分析。差异基因主要在与肿瘤转移相关的生物过程中富集：细胞粘附分子结合、上皮细胞迁移（图3B）和Wnt信号通路（图3D）。这些通路都与肿瘤转移有关。上皮-间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）是肿瘤转移的重要生物学过程。EMT相关基因取自“hallmark_epithelial - epithelial - MESENCHYMAL_TRANSITION”基因列表，使用热图显示（图3C）。对差异基因的富集分析显示，富集通路主要存在于转移相关信号通路中，而在KEGG通路分析中，Wnt通路调控肿瘤转移。RNA-Seq分析显示，在Wnt信号通路中，与对照组相比，PCBP1敲除细胞中有6个基因上调，10个基因下调（图3E）。根据PCBP1的表达情况，将TCGA-LUAD患者分为高表达组和低表达组。在GSEA结果中，PCBP1低表达组也富集了“上皮-间充质转化”通路（图3F）。因此选择了22个基于fold-change和功能的差异基因对PCBP1敲低和过表达细胞进行qRT-PCR以验证RNA测序结果（图3G）。这些发现揭示了PCBP1与LUAD患者转移之间的联系。

图3 PCBP1在转移中的表达

4. PCBP1通过直接结合DKK1 mRNA抑制LUAD进程，延长其mRNA稳定性

DKK1属于与肺癌转移相关的Wnt信号通路。基于以上结果， DKK1可能是影响PCBP1改变时肿瘤转移的关键因素（图4A）。结果表明，在A549和H358细胞中PCBP1敲低可降低DKK1蛋白水平，而在A549细胞中过表达PCBP1可提高DKK1 mRNA水平（图4B）。在蛋白质水平上也观察到了同样的结论（图4C）。PCBP1已被确定为调节许多癌症相关基因的选择性剪接、翻译和RNA稳定性。为了确定PCBP1和DKK1之间的相互作用，进行了RIP分析。RIP分析显示，在A549细胞中，DKK1结合PCBP1（图4D）。此外，利用A549细胞裂解液进行RNA-pull down，然后进行western blot分析和银染（图4E），验证了细胞中DKK1与PCBP1的结合。此外，又评估了DKK1 mRNA对放线菌素D治疗的响应稳定性。PCBP1过表达导致DKK1 mRNA半衰期延长（图4F）。这些结果表明，PCBP1通过稳定DKK1 mRNA密切调控DKK1的表达。

图4 PCBP1介导DKK1 mRNA的稳定性

5. PCBP1通过靶向DKK1抑制Wnt/β - catenin通路

DKK1是β - catenin依赖的Wnt信号通路的抑制剂。DKK1调控失调现已成为多种人类癌症的重要因素。Western blot结果显示，PCBP1敲除细胞中β-catenin表达上调，PCBP1过表达细胞中β-catenin表达下调。然而，phospho-β-catenin的表达则相反（图5A）。此外，western blot检测EMT相关标志物水平，表明PCBP1降低了Vimentin水平，而升高了claudin-1水平（图5A）。Transwell实验显示，与对照细胞相比，sh-PCBP1细胞具有更高的细胞迁移能力（图5B）。接下来，研究PCBP1是否通过调控DKK1在LUAD中抑制细胞迁移和迁移。RT-qPCR结果显示，si-DKK1#1和si-DKK1#2敲除效率较好（图5C）。PCBP1-OE转染A549细胞后，，phospho-β-catenin和claudin-1水平升高，β-catenin和vimentin水平降低，但si-DKK1逆转了这些结果（图5D）。此外，过表达PCBP1的A549细胞的细胞迁移能力明显下降，通过下调DKK1可以消除这种能力（图5E）。综上所述，这些数据表明DKK1是PCBP1的重要下游靶点。

图5 PCBP1/DKK1/β-catenin在LUAD细胞中调节迁移和EMT

6. PCBP1在体内可抑制LUAD的肿瘤生长和转移

采用小鼠尾静脉注射PCBP1敲除细胞的方法，探讨PCBP1在肺转移中的作用。PCBP1基因敲除显著降低了H358小鼠模型的体重，并加重了A549（图6A-C）和H358（图6D-F）小鼠模型的肺转移负担。在皮下异种移植模型中，PCBP1基因敲除组的肿瘤体积似乎比对照组大（图6G,H）。而PCBP1过表达组的肿瘤生长被显著抑制，肿瘤体积更小，重量更轻（图6I）。此外，IHC分析显示，转染sh-PCBP1后肿瘤组织中ki67阳性细胞明显增加。此外，测量BALB/c nu小鼠切除肿瘤的重量，发现PCBP1抑制了肿瘤的生长和重量（图6J）。总之，这些数据表明PCBP1介导肺转移和LUAD肿瘤生长。

图6 PCBP1在LUAD体内抑制肿瘤生长和转移

7. 在LUAD患者中PCBP1与DKK1呈正相关

为了检验这些发现的临床相关性，使用免疫组化染色检测了72名具有配对相邻正常组织的LUAD患者的临床注释队列中PCBP1、DKK1和β-catenin的表达。数据显示，与配对正常肺组织相比，肿瘤组织中DKK1蛋白表达下降，β-catenin蛋白表达增强（图7A, B）。在LUAD患者中，DKK1高表达与生存率的提高密切相关，而β-catenin高表达则预示预后不良（图7C）。同时，IHC染色检测到DKK1和β-catenin的表达与肿瘤的大小，N分期和肿瘤分期有关（图7D）。PCBP1得分较高的组织DKK1表达增加，β-catenin降低。相反，PCBP1得分较低的组织表现出较低水平的DKK1表达和较高水平的β-catenin（图7E）。这些结果表明，在LUAD中PCBP1和DKK1呈正相关（图7F）。PCBP1和DKK1均与β-catenin呈负相关（图7F）。同样的结果在TCGA和GSE19188数据库中得到验证（图7G）。这些结果表明PCBP1与DKK1呈正相关，而PCBP1和DKK1与β-catenin呈负相关，而β-catenin是LUAD OS的独立预后标志物。

图7 高水平的PCBP1和DKK1在LUAD中表达预示着良好的临床结局

结论：

该数据揭示了PCBP1-DKK1-β-catenin在LUAD中的一种新的调控机制，并表明PCBP1可能作为一种与良好预后因素相关的新标志物，强调了PCBP1作为一个有前途的治疗靶点的潜力。