10分免疫新思路——B细胞分化命运的早期机制
抗体介导的免疫是由B细胞分化为包括浆母细胞、记忆细胞和生发中心（GC）细胞在内的多个细胞亚群引发的。B细胞的分化轨迹是由转录因子决定的，然而很少有专门决定早期B细胞命运的机制被描述。本研究中，作者报道了一种抑制浆母细胞遗传程序并促进 GC B细胞命运的转录后机制。本研究于2022年5月发表在《Cell Reports》IF：9.995期刊上。
技术路线：
主要实验结果：
作者希望研究的是在最初的抗原相遇和GC形成之前的这段时期支持B细胞命运决定的机制和基因程序。为了该目的，对免疫响应后GC形成前的腘窝淋巴结的单细胞悬液进行scRNA-seq检测。利用UMAP降维分析了6263个细胞，识别了6个簇，并根据它们的基因表达特征对它们进行了注释（Figures 1A, 1B）。其中一个簇的特征是Igkc和Ighd高表达，Iglc1的低水平表达，并且由于 NP 特异性细胞在B1-8 hi转基因小鼠中表达Igl，所以这个簇被定义为对抗原没有反应的原始B细胞（Figures 1B, 1C）。有两个簇显示了Fas、Cd86和GC转录因子Bcl6的高表达，提示这些细胞处于向GC B细胞分化的过程中（Figures 1B, 1C）。另一个簇表达激活标记Cd86和Fas以及高水平的趋化因子受体Ccr6，这是早期形成记忆细胞(eMBC)的典型特征。一个簇表达Cd86和Fas，但缺乏GC标记，因此被定义为pre-GC细胞。从纯化细胞群的RNA-seq数据集中提取的基因特征用于验证每个集群的细胞分配（Figures 1C）。正如预期的那样，细胞周期分析表明，原始细胞和eMBC大部分是非周期细胞，而一些pre-GC细胞和大部分早期GC B细胞是积极增殖的（Figures 1D）。利用假时间顺序将细胞沿可能的发育轨迹放置，可以预测pre-GC簇可能产生GC B细胞以及eMBC细胞亚群（Figures 1E）。因此，使用scRNA-seq能够识别pre-GC和具有形成成熟GC细胞能力的早期GC B细胞。
为了确定可能指导早期B细胞向GC B细胞定型的分子机制，对在pre-GC 簇中高表达的基因进行了GO富集分析，与原始和eMBC簇相比。在符合这些标准的 991个基因中，359 个基因被注释为编码RBP的基因（Figures 1F）。为了进一步表征早期进入GC B细胞期间RBP的表达，查询了所有注释为编码RBP 的基因 (GO: 0003723)。该分析证实，pre-GC细胞以及早期GC簇的细胞表现出最高的编码RBP基因的表达水平（Figures 1G）。这些结果表明RBP在早期B细胞分化和GC形成中发挥作用。
有趣的是，编码m6a结合蛋白的Ythdf2是符合富集标准的基因之一（在从原始细胞到pre-GC细胞的过渡期间，表达显著增加）（Figures 1H）。通过对Ythdf2表达作为伪时间函数的分析发现，它在发育轨迹的早期上调，从pre-GC细胞开始，在早期GC亚群中保持上调（Figures 1H, 1I）。Ythdf蛋白家族包含3个同源基因，然而，在整个B细胞系中，Ythdf1和Ythdf3的表达显著低于Ythdf2（Figure 1I）。与此相一致的是，利用qRT-PCR和多个引物对分选的B1-8 hi B细胞进行分析，证实Ythdf2在免疫反应早期被诱导，并在抗原特异性B细胞中占主导地位（Figure1J）。这些结果表明Ythdf2h是naive B细胞通过pre-GC状态向早期分化的GC细胞转变的潜在调节剂。
图1 YTHDF2在生发中心形成前B 细胞激活后上调表达
2、抗原特异性B细胞定位于淋巴结外滤泡区表达YTHDF2
接下来，确定YTHDF2蛋白在早期B细胞活化和GC形成过程中在B细胞中的表达模式。流式细胞术分析显示GL-7+ FAS+ B细胞在免疫应答第3天表达YTHDF2蛋白最多，第5天和第7天逐渐减少（Figure 2A）。在多克隆免疫反应中也观察到 YTHDF2 对疫苗接种的强烈上调，该免疫反应包括表达具有不同特异性和亲和力的免疫球蛋白的 B 细胞（Figure 2B）。因此，YTHDF2在抗原特异性B细胞免疫应答早期上调，并且在GC形成期持续表达。
为了检测B细胞在体内表达YTHDF2的部位，将表达YTHDF2-GFP的TdTomato+ B1-8hi B细胞转入宿主小鼠。在反应的第3天，约50%的TdTomato+ B1-8hi B细胞定位至靠近淋巴结包膜区域并高表达YTHDF2-GFP，并且其表达频率在淋巴结皮层深处的区域下降（Figures 2C, 2D）。运动B细胞的实时成像显示，YTHDF2存在于细胞的细胞质中，包括前缘和后缘；然而，由于尾缘含有较多的细胞质，大部分的YTHDF2蛋白质都位于这一区域（Figures 2E）。为了研究免疫球蛋白亲和性是否影响YTHDF2的表达，将B细胞转入表达低亲和性NP特异性BCRs (B1-8lo)和YTHDF2-GFP的小鼠，并将GFP表达与B1-8hi B细胞进行比较。结果发现，在NP-KLH免疫后3天，B1-8hi B细胞表达的YTHDF2水平高于低亲和力的细胞（Figure 2F）。综上所述，这些结果表明YTHDF2在位于淋巴结滤泡外区的B细胞中表达上调，且BCR亲和力调节其表达。
图2 YTHDF2蛋白表达在生发中心形成前上调
3、生发中心的形成依赖于YTHDF2
为了确定YTHDF2是否在抗体免疫反应中发挥作用，将Ythd2fl /fl小鼠与B细胞特异性CD23-Cre小鼠株（CD23-DF2fl/+和CD23-DF2fl/fl）杂交。ELISA结果显示，表达一个或两个Ythdf2-flox拷贝的小鼠血清IgM和IgG1水平较低，表明该基因是单倍不足的（Figure 3A）。为检测抗原特异性抗体的产生情况，用NP-KLH免疫小鼠，免疫1周和2周后ELISA检测血清中NP特异性抗体的存在情况。与野生型相比，CD23-DF2fl/fl小鼠在GC形成的第7天产生低水平的抗体；然而，这种差异在统计上并不显著（Figure 3B）。反应第14天GC形成后，CD23-DF2fl/fl中检测到极低水平的抗原特异性抗体，而CD23-DF2fl/+产生了结合总NPs和低密度NPs的IgG1（Figure 3B）。总的来说，这些实验表明，一个有效的抗体介导的免疫反应依赖于YTHDF2。
由于GC是抗体形成细胞的主要来源，接下来确定GC的形成是否依赖于YTHDF2。首先通过WT小鼠腹腔注射OVA启动，然后过继CD23-DF2fl/fl或WT B1-8hi naive B细胞，然后用NP-OVA增强（Figure 3C）。流式细胞术分析增强7天后腘淋巴结来源的细胞，结果显示，CD23-DF2fl/fl B1-8hi B细胞经过继后分化为GC细胞的比例比对照细胞低3.9倍（Figure 3D）。与对照组相比，缺乏Ythdf2的B细胞的PC/GC比率降低不明显，且PC/GC比率较高（Figure 3D）。流式细胞术分析少数CD23-DF2fl/fl B1-8hi GC B细胞未表达YTHDF2-GFP（Figure 3E）。为了进一步研究YTHDF2在GC形成中的意义，将WT和YTHDF2缺失的B1-8hi B细胞混合转移到WT宿主体内，然后给它们注射NP-OVA促进剂。7d后的流式细胞仪分析显示，在竞争条件下，Ythdf2缺陷的B1-8hi B细胞分化为GC细胞的能力完全受阻（Figure 3F）。因此，YTHDF2对产生完整的抗体介导的免疫反应至关重要，主要是通过促进GC的形成。
图3YTHDF2是有效的抗体介导的免疫反应和生发中心形成所必需的
4、YTHDF2是生发中心形成所必需的而不是早期B细胞激活所需
为了评估YTHDF2是否是早期阶段B细胞免疫应答所必须的，将WT和YTHDF2缺陷的B1-8hi B细胞一起转入宿主小鼠，并在NP-KLH免疫后3-7天通过流式细胞术检测FAS+ GL-7+ B细胞的存在。结果显示，在GC形成前的免疫反应第5天，YThdf2缺陷B细胞的频率显著降低（Figure 4A）。为了研究Ythdf2缺陷如何影响B细胞定位，使用TPLSM扫描完整的淋巴结。免疫后第5天淋巴结皮层可见CD23-DF2+/+ B1-8hi B细胞，第7天可见清晰的GC结构（Figure 4B）。CD23-DF2fl/fl B1-8hi B细胞转染小鼠后第5天检测到细胞簇；但2 d后未形成成熟的GC，提示GC形成需要YTHDF2（Figure 4B）。为了确定YTHDF2是在GC形成过程中发挥作用，而不是在同源抗原的初始激活过程中发挥作用，检测了YTHDF2缺陷的B细胞是否能够在体内对抗原作出反应。免疫16 h后，Ythdf2缺陷的B细胞检测到CD86、MHC-II、CD40等典型激活标志物表达上调（Figure 4C）。此外，CellTrace Violet追踪发现没有早期B1-8hi B细胞增殖缺陷（Figure 4D）。此外，在体外，通过增加anti-IgM剂量刺激B细胞，并没有发现任何显著的增殖缺陷或CD86表达的Ythdf2缺陷B细胞（Figure 4E）。 因此，BCR参与触发的B细胞活化和增殖不依赖于YTHDF2。
图4 YTHDF2是早期B细胞免疫响应所必需的而不是初始的B细胞激活所需
5、YTHDF2 抑制GC形成期间浆母细胞遗传程序
体内实验之间的差异表明，GC 形成对 YTHDF2 有很大依赖性，而在没有 YTHDF2 的情况下，早期 B 细胞活化和增殖没有受到干扰，这表明这种 m6A 阅读器在 B 细胞分化和命运决定中发挥作用，而不是在细胞周期进程和克隆扩增中发挥作用。为了进一步评估YTHDF2对B细胞发育哪个阶段至关重要，研究了支持B细胞命运的遗传程序。筛选WT和Ythdf2缺陷的B1-8hi B细胞，这些细胞在免疫接种5天后对受体宿主的抗原产生反应，并对它们进行RNA-seq。总计获得159个差异表达基因，值得注意的是，PB和PC中典型表达的基因，如Irf4、Xbp1、Sdc1和Prdm1，在Ythdf2缺陷的GL-7+ FAS+ B细胞中高表达（Figures 5A and 5B）。这些变化反映在GSEA揭示的ASC基因信号的表达增加（Figures 5C）。因此，YTHDF2在B细胞免疫反应的早期阶段抑制PB基因程序。
为了进一步研究在缺乏YTHDF2的情况下早期反应的B细胞的细胞命运，进行了scRNA-seq分析，共有11227个细胞显示了类似于图1中描述的集群（Figure 5D）。然而，尽管Ythdf2缺陷的B细胞分化为pre-GC和eMBC亚群，但它们形成的早期GC B细胞明显较少（Figure 5E）。与转录组结果一致，发现响应的Ythdf2缺陷B细胞形成了相对更多的PC，与对照B细胞比较（Figure 5F）。接下来，研究了早期FAS+ GL-7+ Ythdf2缺陷的B细胞是否除了ASC基因表达增加外，还具有PB相关功能。为了确保亚型特异性转录本的检测，使用分选的多克隆naive B细胞作为阴性对照，PC作为阳性对照。如预期的，如果有sIgM转录本的话，naive B细胞表现得非常低，而PC显示sIgM与mIgM转录本的比例非常高（Figure 5G）。这些结果为YTHDF2在pre-GC和GC早期抑制PB遗传程序中的作用提供了额外的证据。
6、YTHDF2直接与浆母细胞调节基因的甲基化mRNA相互作用
由于前文的研究结果表明YTHDF2在抑制PB遗传程序中发挥作用，作者试图确定该蛋白是否可以直接靶向PB促进基因。为此，用脂多糖刺激分离的B细胞3天，在体外生成表达PB基因的细胞。然后，使用抗m6a抗体进行RNA免疫沉淀，并使用高通量测序作为读数。IP与对照组的比较显示，在Ythdf2缺陷B细胞中上调的几个PC分化基因，包括Prdm1、Sdc1、Xbp1和Irf4，显示出一个或多个m6A峰（Figure 6A）。此外，通过分析已发表的YTHDF2 IP在B细胞发育过程中的数据集发现Irf4和Xbp1转录本都直接与YTHDF2结合（Figure 6B）。Sdc1也与YTHDF2结合；然而，这个峰值在缺乏mRNA甲基化机制的细胞中持续存在，表明非特异性结合。从LPS刺激的转基因B细胞中提取HA-YTHDF2-GFP进行RNA免疫沉淀，然后进行qRT-PCR，得到类似的结果（Figure 6C）。这些发现表明YTHDF2有可能在转录后水平直接调节PC分化基因。
在早期反应的B细胞中上调的PB相关基因中，Irf4被认为是最上游的B细胞命运调控因子。免疫后5天对CD23-DF2+/+和CD23-DFfl/fl细胞中IRF4蛋白表达的分析表明，与对照相比，CD23-DFfl/fl 细胞中显示高水平 IRF4 的活化 CD138 阴性 B 细胞的频率是对照组的 2.5 倍，并且通过平均荧光强度测量检测到每个细胞的蛋白质水平增加（Figure 6D）。激活的和Ythdf2缺乏的B细胞中也检测到MYC蛋白水平的小幅升高（Figure 6E）。这些结果表明，YTHDF2具有通过调节IRF4 mRNA和蛋白表达水平直接调控PC形成的潜力。
图6浆母细胞调节基因转录物是 YTHDF2 的直接靶标
7、生发中心和浆母细胞的形成不依赖于YTHDF1或YTHDF3
YTHDF蛋白在结构上非常相似，几项研究表明，所有三个同源段都促进RNA降解，并可以补偿任何同源段的损失。由于本文的结果显示Ythdf2的一个等位基因不足以产生完整的抗体介导的免疫反应，所以测试了YTHDF1和YTHDF3是否也有助于GC的形成。与Ythdf2缺陷B细胞相反，过继转染Ythdf1-和Ythdd3缺陷B1-8hi B细胞可有效生成GC细胞和PC细胞（Figures 7A and 7B）。在竞争条件下检测到Ythdf1缺陷的PCs和GC细胞频率较高，而Ythdf3缺陷的B细胞这些细胞亚群的频率没有变化（Figures 7C and 7D）。这些结果表明，与YTHDF2相比，Ythdd1/3序列不通过对B细胞中YTHDF总蛋白库的贡献来促进GC B细胞的形成。流式细胞仪检测免疫后第3、5、7天B1-8hi B细胞，显示FAS+ GL-7+ B1-8hi B细胞的形成不需要YTHDF1和YTHDF3（Figure 7E）。然而，来自免疫小鼠的FAS+ GL-7+ B1-8hi B细胞的RNA-seq实验显示，在Ythdf2缺陷B细胞中显著差异表达的基因在缺少Ythdf1和Ythdf3的情况下也发生了类似的改变，尽管程度较轻（Figures 7F and 7G）。虽然没有在Ythdf1和Ythdf3缺陷B细胞的基因表达数据集中检测到IRF4水平的增加，但在Ythdf3缺陷B细胞中观察到ASC信号的增加（Figures 7G）。因此，YTHDF2在B细胞中起主导作用，而非YTHDF1和YTHDF3，这是由于它在B细胞中高表达。
图7生发中心的形成不依赖于YTHDF1和YTHDF3
总之，本研究使用scRNA-seq 和转基因小鼠证明YTHDF2由早期反应的抗原特异性B细胞表达，并通过抑制与浆细胞形成相关的基因促进其分化为生发中心 B细胞，而其他YTHDF旁系同源物对于体液免疫反应是可有可无的。
图8图文摘要
参考文献：
Grenov Amalie., Hezroni Hadas., Lasman Lior., Hanna Jacob H., Shulman Ziv. (2022). YTHDF2 suppresses the plasmablast genetic program and promotes germinal center formation. Cell Rep, 39(5), 110778. doi:10.1016/j.celrep.2022.110778