MARCKSL1–2-改善肺腺癌化疗的靶点

栏目:最新研究动态 发布时间:2022-09-15
MARCKSL1–2通过阻断HDAC1对miR-200b启动子组蛋白乙酰化修饰的抑制作用上调miR-200 b。小鼠异种移植肿瘤......


lncRNAs与多种癌症的发生有关。在我们之前的研究中,我们证明HDAC1/4介导的miR-200b沉默增强了人肺腺癌(LAD)细胞对多西紫杉醇(DTX)的耐药性。在此,我们探讨了LncRNA MARCKSL1–2在LAD细胞DTX抗性中的作用。我们发现在DTX抗性的LAD细胞中,MARCKSL1–2表达显著降低。MARCKSL1–2抑制亲代和DTX抗性的LAD细胞的生长和DTX耐药性。此外,我们发现,MARCKSL1–2通过增加miR-200b表达和抑制HDAC1在LAD中发挥作用。从机制上讲,MARCSKL1–2将SUZ12招募到HDAC1的启动子,以加强HDAC1启动子的H3K27me3,从而降低HDAC1的表达。MARCKSL1–2通过阻断HDAC1对miR-200b启动子组蛋白乙酰化修饰的抑制作用上调miR-200 b。小鼠异种移植肿瘤模型的体内分析表明MARCKSL1–2的过表达减弱LAD肿瘤中的DTX抗性。本文于2022年7月发表于Molecular Cancer(IF=41.444)上。


技术路线



结果

1MARCKSL1-2的下调与LAD患者的DTX耐药性和不良预后相关

根据肿瘤对化疗的反应,将60例LAD组织分为DTX不敏感组(SD+PD)和敏感组(CR+PR)。有趣的是,RT-qPCR数据表明,与敏感组相比,不敏感LAD组织中的MARCKSL1–2水平显著下调(图1a)。此外,肿瘤组织中的MARCKSL1–2水平低于正常肺组织中的水平(图1b)。Kaplan-Meier分析结果显示,较低的MARCKSL1–2水平与LAD患者的PFS和OS较短相关(图1c-d)。基于上述数据,我们评估了MARCKSL1–2与LAD细胞中DTX抗性的相关性。RT-qPCR揭示,与亲代细胞相比,耐DTX的LAD细胞中的MARCKSL1-2水平显著下降(图1e),表明MARCKSL1-2与人类LAD细胞的耐DTX相关。在探索其功能之前,我们分析了MARCKSL1–2的细胞分布。数据显示MARCKSL1–2主要存在于细胞核中(图1f-g)。类似地,FISH图像表明,MARCKSL1–2的染色主要在细胞核中,抗性细胞中观察到的MARCKSL1–2信号少于亲代细胞(图1h)。这些结果表明,MARCKSL1–2在DTX抗性的LAD细胞中低水平表达。



2MARCKSL1-2DTX处理下耐DTX或敏感LAD细胞行为的影响

为了确定MARCKSL1–2在LAD细胞中的生物学功能,我们沉默了H1299和SPC-A1细胞中的MARCKSL2表达,同时上调了H129P/DTX和SPC-A1/DTX细胞中的MARCKSL1–2表达。当MARCKSL1–2在H1299和SPC-A1细胞中沉默时,增殖能力明显增强。相反,MARCKSL1–2的过表达阻碍了H1299/DTX和SPC-A1/DTX细胞的增殖(图2a-d)。此外,流式细胞仪和TUNEL检测结果显示,5、10 μg/L DTX作用下,缺失MARCKSL1-2可降低H1299和SPC-A1细胞的凋亡率,而上调MARCKSL1-2可诱导0、50、100 μg/L DTX作用下H1299/DTX和SPC-A1/DTX细胞的凋亡率(图2e-h)。这些结果表明,MARCKSL1–2在DTX敏感和耐药LAD细胞中均起到生长抑制作用。



3MARCKSL1-2通过调节HDAC1miR-200b减轻LAD细胞的DTX抗性

我们先前的研究表明,HDAC1/4和miR200b参与LAD细胞的DTX抗性。在此,我们研究了MARCKSL1–2是否可以调节HDAC1/4和miR-200以降低DTX抗性。有趣的是,我们发现MARCKSL1–2在亲代和DTX抗性LAD细胞中负调节HDAC1,正调节miR-200b(图3a-d)。由于MARCKSL1–2主要分布在LAD细胞的细胞核中,我们评估了MARCKSL2–2对HDAC1和miR-200b转录的影响。来自荧光素酶报告分析的数据显示,在H1299和SPC-A1细胞中,MARCKSL1-2敲低后miR-200b启动子荧光素酶强度降低,而在H1299/DTX和SPC-A1/DTX细胞中,MARCKSL1-2上调后miR-200b启动子荧光素酶强度升高(图3e)。相反,在所示细胞中,HDAC1启动子的荧光素酶活性显示出与miR-200b启动子相反的趋势(图3f)。更重要的是,经验证,通过HDAC1干扰或miR-200b模拟,可以抵消由MARCKSL1–2敲除诱导的DTX IC50值的增强,并且在HDAC1过表达或miR-200b抑制的情况下,由MARCSKL1–2过表达介导的DTX的IC50值降低得以恢复(图3g,j)。总之,MARCKSL1–2通过抑制HDAC1或升高miR-200b来减弱LAD细胞中的DTX抗性。



4MARCKSL1-2LAD细胞中招募SUZ12

根据先前的报告,HDAC1/4缺失可以通过维持miR-200b启动子处的组蛋白H3乙酰化来提高miR-200b的表达,从而逆转LAD细胞的DTX抗性。基于此,我们假设MARCKSL1–2可以通过增强miR-200b启动子处的组蛋白H3乙酰化水平来抑制HDAC1上调miR-200b。芯片分析显示,MARCKSL1–2的减少抑制,而其上调增强了miR-200b启动子的组蛋白-H3乙酰化水平(图4a-b)。接下来,我们探讨了MARCKSL1–2影响HDAC1转录的机制。我们采用RNA下拉和银染色来分析与MARCKSL1-2相互作用的潜在蛋白质。我们发现SUZ12与MARCKSL1-2以高结合分数相互作用(图4c)。此外,我们证实了SUZ12在亲代和DTX抗性LAD细胞中的MARCKSL1–2下拉复合物中的存在(图4d)。同时,RIP数据显示,MARCKSL1–2在抗SUZ12组中高度富集,其在DTX抗性LAD细胞中的富集程度高于亲本细胞(图4e-f)。此外,我们检测了MARCKSL1–2对SUZ12 mRNA水平和蛋白质水平的影响。结果表明,MARCKSL1–2不能影响不同LAD细胞中SUZ12的表达(图4g-h)。这些结果表明,MARCKSL1–2在亲代和DTX抗性LAD细胞中与SUZ12相互作用。



5MARCKSL1-2通过招募SUZ12HDAC1启动子来影响 HDAC1的表达

SUZ12是PRC2复合物的关键亚单位,其调节靶基因的H3K27甲基化。因此,我们进一步探讨了MARCKSL1–2是否通过招募SUZ12来调节HDAC1转录。我们首先分析了SUZ12对HDAC1的影响。我们发现SUZ12上调降低了SPC-A1和H1299细胞中HDAC1 mRNA和蛋白水平,而SUZ12的缺失导致H1299/DTX和SPCA1/DTX细胞中HDAC1水平升高(图5a-b)。随后,ChIP检测显示,HDAC1启动子在亲本和DTX耐药LAD细胞SUZ12组均富集,且DTX耐药细胞中HDAC1启动子的富集量低于亲本细胞(图5c-d)。此外,HDAC1启动子中的H3K27me3水平因SUZ12上调而增强,而在SUZ12下调时降低(图5g)。更有趣的是,在SPC-A1和H1299细胞中,MARCKSL1–2敲除明显减少了SUZ12组中HDAC1启动子的富集,而在SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞中,当MARCKSL1–2上调时,HDAC1启动子的富集增强(图5f-g)。在MARCKSL1–2干扰下,HDAC1启动子中的H3K27me3水平降低,但在MARCKSL1–2过表达时增加(图5h)。这些结果表明,MARCKSL1–2通过招募SUZ12诱导HDAC1启动子处的H3K27me3修饰来阻碍HDAC1的表达。



6MARCKSL1-2通过调节HDAC1/miR-200b轴影响LAD细胞的DTX抗性

接下来,我们测试了MARCKSL1–2是否通过调节HDAC1和miR-200b来调节LAD细胞的DTX抗性。我们进行了功能实验。集落形成和EdU分析的结果显示,MARCKSL1–2敲除提高了H1299和SPC-A1细胞的增殖能力,并且在HDAC1抑制或miR-200b模拟下,升高的增殖被彻底逆转。同时,在HDAC1上调或miR-200b抑制的情况下,受MARCKSL1–2上调阻碍的H1299/DTX和SPC-A1/DTX细胞的增殖能力完全恢复(图6a-d)。流式细胞术和TUNEL分析的数据显示,HDAC1敲低或miR-200b模拟可挽救因MARCKSL1-2缺失而对LAD细胞凋亡的抑制作用。相反,HDAC1过表达或miR-200b抑制完全消除了MARCKSL1-2上调对DTX抗性LAD细胞凋亡的增强作用(图6e-h)。这些结果表明,MARCKSL1–2通过调节HDAC1/miR-200b轴减轻LAD细胞的DTX抗性。



7MARCKSL1-2在体内减轻LAD肿瘤的DTX抗性

为了进一步验证MARCKSL1–2在体内DTX耐药性中的意义,我们构建了小鼠模型,并观察了不同治疗下小鼠的肿瘤生长情况。与对照组相比,MARCKSL1–2过表达或DTX治疗组的肿瘤大小、体积和重量更小,并且在DTX治疗的组中,MARCSKL1–2过表达导致上述参数进一步降低(图7a-c)。因此, MARCKSL1–2在体内增强了LAD细胞对DTX治疗的敏感性。



结论:我们的研究阐明了MARCKSL1–2/SUZ12/HDAC1/miR-200b轴在LAD细胞生长和DTX抗性中的抑制作用,表明MARCKSL2–2可能是改善LAD患者化疗的一个有希望的靶点。


参考文献:

Jiang M, Qi F, Zhang K, Zhang X, Ma J, Xia S, Chen L, Yu Z, Chen J, Chen D. MARCKSL1-2 reverses docetaxel-resistance of lung adenocarcinoma cells by recruiting SUZ12 to suppress HDAC1 and elevate miR-200b. Mol Cancer. 2022 Jul 21;21(1):150. doi: 10.1186/s12943-022-01605-w.