组织中细胞外囊泡的分离方法

细胞外囊泡(EVs)是一种异质性的双层膜纳米粒子，在细胞间的信息传递中起着重要的作用。EVs可以介导肿瘤细胞迁移、侵袭、血管生成和细胞存活。此外，来自多种类型癌症的EVs已被证明具有诊断和预后价值，这可能会改善未来的癌症治疗方案。根据其生物起源和大小的差异，EVs通常被分为两个亚组，微泡和外泌体。微泡由质膜上出芽形成，其直径约为100-1000 nm。外泌体在多泡小体中产生，并通过胞吐途径被释放到细胞外部，其直径约为30-200 nm。迄今为止，大多数的EVs研究都是在细胞系上进行的，但对这些研究如何代表EVs在体内的特征知之甚少。在此总结一种优化后的从组织中分离EVs的方法。优化主要是在黑色素瘤转移组织上进行的，但该方案已应用于其他几种类型的癌症以及小鼠和人类的健康组织。详细操作步骤如下(图1)：

1. 收集样品

收集组织后，将其保存在冰上的PBS中，然后立即进行EV分离处理。

2. 分离组织

将组织轻轻地分解成小块(约2×2×2 mm)。

3. 酶的孵化

将分解后的组织与胶原酶D和DNase I在37℃下孵育30 min，在旋转搅拌机上以24 rpm/min的速度轻微搅拌，这一步骤使EVs从包裹它们的组织碎片中分离出来。

4. 过滤

采用70 µm孔径过滤器，通过过滤步骤去除最大的元素。

5. 差速离心

剩余液体分别用300 g和2000 g差速离心10 min，以清除细胞和组织碎片。将上清液16,500 g离心20 min收集大型EVs(lEVs)的粗馏分，118,000 g离心2.5 h收集小型EVs(sEVs)的粗馏分。

6. 密度梯度

为了进一步处理，lEVs和sEVs装载在单个碘二甲醇密度梯度(OptiPrep)上。将粗制EVs溶解在60%(wt/vol)OptiPrep溶液中，然后在其上放置一个间断的OptiPrep梯度溶液(35%、30%、28%、24%、22% × 2和20%(wt/vol))。186,000 g离心16 h后，共收集4个EVs亚种群。两个EVs亚种群被命名为“大、小低密度(LD)EVs”，从20-22%(wt/vol)碘二醇层的界面收集(约1.111-1.121 g/cm3)，另外两个亚种群称为“大、小高密度(HD)EVs”，从30-35%(wt/vol)碘二醇层的界面收集(约1.163-1.189 g/cm3)。

图1. 组织衍生EVs的分离程序示意图概述