ALKBH5可能通过降低PHF20 mRNA甲基化抑制结直肠癌进展

m6A是最广泛的mRNA修饰，被甲基转移酶和去甲基酶动态地、可逆地调控。ALKBH5是一种主要的去甲基化酶，在癌症的进展中起着至关重要的作用。然而，ALKBH5在结直肠癌(CRC)中的作用和机制尚不清楚。我们发现，在CRC中，ALKBH5的下调与CRC患者预后不良密切相关。在功能上，敲低ALKBH5可增强LOVO和RKO细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而过表达ALKBH5可抑制这些细胞的功能。结果还表明，敲除ALKBH5可促进LOVO在体内的皮下肿瘤发生，而过表达ALKBH5可抑制这种能力。在机制上，MeRIP-seq和RNA-seq的联合分析结果表明，PHF20 mRNA是一个受ALKBH5介导的m6A修饰调控的关键分子。进一步的实验表明，ALKBH5可能通过去除PHF20 mRNA 3'UTR的m6A修饰来抑制PHF20 mRNA的稳定性。总之，ALKBH5通过降低PHF20 mRNA甲基化抑制CRC进展。ALKBH5介导的PHF20 mRNA的m6A修饰有望成为CRC的干预和治疗策略。本文于2022年6月发布于“Clinical and Translational Medicine”（IF=8.554）上。

技术路线

结果：

1）ALKBH5在CRC中表达下调

为了评估ALKBH5在癌症中的表达，我们初步检测了TCGA数据集中23个实体癌症中ALKBH5的mRNA表达。在12例实体癌中，与相邻正常组织相比，ALKBH5明显失调(图1A)。与相邻正常组织相比，ALKBH5在7种实体癌(CRC、GBM、KICH、KIRP、PRAD、THCA和UCEC)中显著下调，在5种实体癌(CHOL、HNSC、KIRC、LIHC和LUSC)中上调。我们发现，与相邻正常组织相比，TCGA-CRC队列中肿瘤组织中的ALKBH5明显减少。我们还从GEO数据集中下载了CRC的RNA测序数据。结果证实了CRC组织中ALKBH5 mRNA的减少(图1 B)。RT-qPCR结果显示，CRC组织中ALKBH5 mRNA表达明显低于相邻正常组织(图1C)。我们还评估了ALKBH5蛋白在CRC中的表达。免疫组化检测结果显示，CRC组织中ALKBH5蛋白表达明显降低(图1D,E)。此外，mRNA的m6A 定量分析表明，CRC组织中mRNAs的m6A修饰水平较高(图1F)。

2）ALKBH5缺失预示CRC患者预后较差

为了探讨ALKBH5的临床价值，我们从mRNA和蛋白水平分析了ALKBH5与CRC患者临床病理特征的相关性。结果表明，在mRNA水平上，下调ALKBH5与远处转移和临床晚期显著相关(图2A, B)。一致地，在蛋白水平上，下调的ALKBH5与远处转移和临床晚期显著相关(图2D, E)。Kaplan-Meier分析表明，缺失ALKHB5的CRC患者在mRNA(图2C)和蛋白(图2F)水平上的总生存期都较短。

3）敲除ALKBH5可促进结肠癌细胞的生长和转移

我们探索了ALKBH5对结肠癌细胞功能的影响。我们初步鉴定了五种结肠癌细胞中ALKBH5的mRNA表达，并注意到与其他结肠癌细胞系相比，LOVO和RKO细胞中ALKBH5表达升高(图3A)。在LOVO和RKO细胞中使用三种特定的siRNA敲除ALKBH5(图3B,C)。利用敲除效率高的两个siRNA (siALKBH5-2, siALKBH5-3)构建敲除质粒(shALKBH5-2, shALKBH5-3)，用于后续实验。我们使用两个独立的ALKBH5敲除慢病毒构建了两个稳定的细胞系。在mRNA和蛋白水平上验证敲除效率(图3D-F)。随后，CCK-8实验显示，ALKBH5敲除显著增强了细胞生长，以及LOVO和RKO细胞的活力(图3G)。通过克隆形成实验证实，敲除ALKBH5可显著提高LOVO和RKO细胞的克隆形成能力(图3H)。此外，我们使用transwell实验评估了LOVO和RKO细胞的迁移和侵袭能力。结果表明，敲除ALKBH5可显著提高细胞迁移和侵袭能力(图3I,J)。为了进一步确定ALKBH5在体内是否影响结肠癌细胞功能，我们建立了异种移植瘤模型。我们发现，当ALKBH5敲低的LOVO细胞植入时，肿瘤生长速度更快(图4C)，肿瘤体积和重量增加(图4A,B,D)。

4）过表达ALKBH5可抑制结肠癌细胞的生长和转移

我们还利用慢病毒载体构建了过表达ALKBH5的稳定转染细胞系，RT-qPCR和Western blot实验验证了过表达效率(图5A-C)。CCK-8实验显示，过表达ALKBH5显著抑制细胞生长和LOVO和RKO细胞的活力(图5D)。集落形成实验证实，过表达ALKBH5导致LOVO和RKO细胞集落形成能力显著降低(图5E)。此外，通过transwell分析，过表达ALKBH5大大削弱了细胞迁移和侵袭能力(图5F,G)。然后，我们的肿瘤异种移植模型的结果表明，当移植过表达ALKBH5的LOVO细胞时，肿瘤生长速度较慢(图6C)，肿瘤体积和重量降低(图6A,B,D)。

5）ALKBH5靶向PHF20

为了鉴定m6A修饰的靶点，我们收集了六名CRC患者的肿瘤组织和正常组织，用于MeRIP-seq。我们通过MeRIP-seEq在六对组织中鉴定了1343个调节失调的m6A峰（图7A）。其中，625个m6A峰在肿瘤组织中被高甲基化，而718个m6A峰在肿瘤中被低甲基化（图7A）。接下来，625个高甲基化m6A峰分布在265个基因的转录本中，718个低甲基化m6A峰分布在311个基因转录本中。有趣的是，我们发现，在MeRIP序列的六对组织中，肿瘤组织中ALKBH5的表达明显低于正常组织中的表达（图7B）。我们假设这265个基因的转录由ALKBH5调控。为了进一步探索由ALKBH5调控的m6A修饰靶点，我们在ALKBH55敲除的LOVO细胞和对照细胞中进行了RNA序列分析。结果表明，ALKBH5敲除后，679个基因差异表达，包括362个上调基因和317个下调基因（图7C，D）。结合MeRIP-seq和RNA-seq，我们发现19个基因通过m6A修饰潜在地受ALKBH5调控，包括11个上调基因（PCDH7、QSOX1、LAM5、CCDC69、LITAF，MDK, TGFB1I1, ATP2B4, DUSP3, PHF20和PLIN3) 和8个下调基因（NPNT、KRT20、PCSK7、SAMD4A、NEDD4L、SLC35A3、SPTLC2和DNM1L）（图7E）。然后，我们检测了这19个基因在ALKBH5敲除后的表达情况。RT-qPCR结果显示，11个上调基因中，5个基因(CCDC69、LITAF、TGFB1I1、PHF20和PLIN3)在ALKBH5基因敲除的LOVO和RKO细胞中均上调(图7F)。此外，我们发现，在8个下调基因中，只有PCSK7在ALKBH5敲除的LOVO和RKO细胞中下调（图7G）。接下来，我们检查了ALKBH5与TCGA数据库中六个候选基因之间的相关性。我们的结果表明，在CRC中，只有PHF20与ALKBH5呈负相关（图7H）。我们还通过Western blot检测验证了与对照细胞相比，ALKBH5敲除细胞中PHF20蛋白表达的升高(图7I)。此外，可视化分析表明，与正常组织相比，PHF20 mRNA的m6A峰在肿瘤组织中更为丰富（图7J）。因此，PHF20可能是通过m6A修饰由ALKBH5调节的关键分子。

6）ALKBH5的缺失增加了PHF20 mRNA的稳定性，进而促进结肠癌的进展

作为去甲基酶，ALKBH5能够从mRNA中去除m6A修饰。mRNA的m6A定量分析表明，ALKBH5缺失显著增加了mRNA的m6A修饰水平（图8A）。MeRIP qPCR分析表明，ALKBH5缺失显著增加了PHF20 mRNA的m6A修饰水平（图8B）。接下来，我们利用SRAMP数据库和和BEMP数据库预测PHF20 mRNA的m6A位点。我们发现PHF20 mRNA上的m6A甲基化位点主要位于3′UTR，并且有8个可能的m6A甲基化位点。根据PHF20 mRNA上的m6A甲基化位点，我们构建了荧光素酶报告载体（图8C）。荧光素酶报告分析表明，ALKBH5缺失显著增强野生型PHF20 3’UTR质粒的表达，但对具有m6A突变位点的PHF20 3’UTR质粒没有显著影响（图8D）。为了评估ALKBH5对PHF20 mRNA稳定性的影响，我们用放线菌素D处理结肠癌细胞，发现ALKBH55缺失改善了PHF20的稳定性并延长了其半衰期（图8E）。然后我们进行拯救实验，以确定ALKBH5是否通过调控PHF20影响结肠癌细胞的生物学功能。结果显示，PHF20敲除抑制了shALKBH5介导的LOVO和RKO增殖、菌落形成、迁移和入侵的增强(图8F-I)。

结论：

我们确定ALKBH5表达在CRC中下调，并起到关键的肿瘤抑制作用。机制上，ALKBH5通过去除m6A修饰抑制PHF20 mRNA的稳定性。我们的研究为ALKBH5介导的m6A修饰的抗癌作用提供了新的见解，并表明靶向ALKBH5介导的PHF20 mRNA的m6A修饰可能是一种有希望的结肠癌干预和治疗策略。

参考文献：

Zhang Z, Wang L, Zhao L, Wang Q, Yang C, Zhang M, Wang B, Jiang K, Ye Y, Wang S, Shen Z. N6-methyladenosine demethylase ALKBH5 suppresses colorectal cancer progression potentially by decreasing PHF20 mRNA methylation. Clin Transl Med. 2022 Aug;12(8):e940. doi: 10.1002/ctm2.940.