circCRKL是一种来源于CRKL的环状RNA，通过海绵化miR-877-5p调控BCR-ABL，促进慢性髓系白血病细胞增殖

BCR-ABL融合蛋白是导致慢性粒细胞白血病（CML）发生的关键因素。伊马替尼（IM）是一种靶向BCR-ABL抑制剂，可达到完全缓解。然而，缓解失败是由于继发性BCR-ABL突变引起的获得性耐药，这强调了对新型BCR-ABL靶向策略的需求。近年来研究发现，来源于肿瘤相关基因的环状RNA （circRNA）可能是相关肿瘤的治疗靶点，但在CML中，这类circRNA的作用尚不清楚。目前有研究揭示了circCRKL在BCR-ABL+细胞中特异表达并通过诱变miR-877-5p调控BCR-ABL表达水平，这表明靶向circCRKL联合IM治疗可作为一种潜在的CML患者治疗策略。该研究发表在《Journal of Translational Medicine》，IF: 8.44。

技术路线：

主要研究结果：

1. circCRKL在CML细胞系和临床样本中的特征

为揭示circCRKL在CML中的潜在作用，采用RT-qPCR检测6例CML患者和3例正常供体BMMCs中circCRKL的表达。相对于正常供体，circCRKL在CML患者中大量表达（图1 A）。BCR-ABL+细胞系（K562、K562/G01、KCL22和SupB15）与BCRABL -细胞系（TK6和THP-1）进行比较时，circCRKL在BCR-ABL+细胞系中的表达显著增高（图1B）。这些结果提示circCRKL与BCR-ABL之间可能存在联系。生信信息学分析，发现circCRKL是一个466 nt的circRNA，由pre-CRKL的2外显子反向剪接，采用Sanger测序确定环化位点（图1C）。RT-qPCR和RNA分离检测结果发现，CML细胞中circCRKL在细胞质中的表达水平高于细胞核中的表达水平（图1D, E），荧光原位杂交（FISH）进一步证实了这一结果（图1F）。RNase R分析显示线性CRKL的表达显著减少，而circCRKL没有变化，表明circCRKL在CML细胞中是稳定的（图1G, H）。放线菌素D处理，确定了circCRKL和线性CRKL的半衰期，发现circCRKL的半衰期比线性CRKL的半衰期更长（图1I, J）。circCRKL是一种稳定的circRNA，定位于CML细胞的细胞质并呈高表达，提示circCRKL在CML中具有潜在作用。

图1在BCR-ABL+细胞系和CML样品中识别和表征circCRKL

2. circCRKL促进体外BCR-ABL+细胞增殖

通过功能缺失试验探讨circCRKL在CML中的生物学作用。构建circCRKL敲低CML细胞，CML细胞中的circCRKL表达明显受到抑制，而线性CRKL表达不受影响（图2A, B）。CCK-8和集落形成实验发现，抑制circCRKL显著降低了CML细胞生长（图2C−F）。流式细胞术检测显示，circCRKL沉默减少了S期细胞的数量（图2G, H）。综上所述，在BCR-ABL+细胞中，circCRKL是特异性需要的，抑制circCRKL可抑制增殖。

图2 circCRKL体外促进CML细胞增殖

3. circCRKL沉默可在体内损伤CML细胞的肿瘤发生

将Sh-NC或sh-circCRKL慢病毒感染的K562/G01细胞分别静脉注射到免疫缺陷NOD/SCID小鼠体内，建立了CML小鼠模型。与预期的一样，对照组小鼠的白细胞计数比敲低组小鼠增加更多，但没有明显的差异（p=0.0586）（图3）。此外，与sh-NC组小鼠相比，敲低circCRKL减轻了脾肿大，但肝脏重量没有明显缺陷（图3B, C）。为评估白血病细胞的浸润，在小鼠骨髓、肝脏和脾脏中进行瑞氏染色。结果显示，sh-NC组异种移植模型中有更严重的浸润（图3D），苏木精/伊红（HE）染色也证实了这一点（图3E）。免疫荧光显示circCRKL沉默小鼠中BCR-ABL的水平要低得多（图3F）。综上所述，circCRKL在体内可以促进CML的恶性进展。

图3 circCRKL在体内促进CML细胞增殖

4. circCRKL调控BCR-ABL的表达，miR-877- 5p是circCRKL和BCR-ABL的靶点

western blot显示抑制circCRKL的细胞中BCR-ABL和c-ABL蛋白水平降低（图4A）。免疫荧光法的结果与上述结果一致（图4B）。RT-qPCR表明，敲低circCRKL降低了BCR-ABL mRNA的表达（图4C），表明circCRKL可能在mRNA水平调控BCR-ABL。然而，circCRKL控制BCR-ABL的机制尚不清楚。

circCRKL主要存在于CML细胞的细胞质中，这是circCRKL发挥miRNA海绵功能的关键前提。因此，从三个数据库（circInteractome、circBank和ENCORI）中筛选了circCRKL的下游miRNA（图4D）。ENCORI，TargetScan和miRwalk数据库预测与ABL结合的miRNAs。然后将circCRKL和ABL的miRNAs进行重叠（图4E）。在候选miRNA中，miR-877-5p是一种独特的包含circCRKL和ABL-3'UTR结合位点的miRNA（图4F），这是通过双荧光素酶报告基因检测证实的。当miR-877-5p异位表达时，野生型circCRKL报告基因的荧光素酶活性显著降低，但突变型报告基因的活性未受影响，这表明circCRKL可能与miR-877-5p在特定位点发生相互作用（图4G），miR-877-5p和ABL之间也观察到类似的结果（图4H）。RNA pull-down实验进一步验证circCRKL与miR-877-5p的结合。RT-qPCR显示miR-877-5p在K562/G01细胞中被circCRKL探针特异性富集（图4I）。此外，先前的研究已经注意到AGO2对于circRNA充当miRNA海绵的重要性。在此，进行了anti-AGO2 RNA免疫沉淀，发现circCRKL和miR-877-5p都可以相互作用，这意味着circCRKL可能充当miR-877-5p的海绵（图4J）。

图4 circCRKL沉默CML细胞中BCR-ABL水平下调

5. miR-877-5p通过调节抑制CML细胞增殖BCR-ABL

为了明确miR-877-5p在CML中的生物学相关性以及BCR-ABL是否受miR-877-5p的调控，测定了CML患者BMMCs中miR-877-5p的表达水平（图5A），然后分别使用抑制剂或模拟物敲低或过表达miR-877-5p。通过RT-qPCR检测抑制剂或模拟物对CML细胞中miR-877-5p的影响（图5B, C）。抑制miR-877-5p后，BCR-ABL mRNA表达显著上调，而过表达miR-877-5p后，BCR-ABL mRNA表达显著降低（图5D）。同样，western blot显示抑制miR-877-5p可增强BCR-ABL蛋白水平，而过表达miR-877-5p则表现出相反的作用（图5E）。CCK-8（图5F, G）和集落形成实验（图5H, I）显示，抑制miR-877-5p刺激CML细胞增殖，而miR-877-5p过表达则相反。综上所述，这些发现揭示了miR-877-5p是BCR-ABL的负调控因子。

图5 miR-877-5p调控BCR-ABL表达

6. circCRKL通过海绵状miR-877-5p调控BCR - ABL促进CML细胞增殖

共转染shcircCRKL和miR-877-5p抑制剂进行挽救实验：CCK-8和集落形成实验显示，敲低miR-877-5p明显恢复了在CML细胞中抑制circCRKL引起的生长抑制（图6A-D），改善了circCRKL抑制导致的BCR-ABL水平降低（图6E）。共转染sh-circCRKL和miR-mimic的CML细胞中BCR-ABL蛋白水平低于sh-circCRKL+mimic-NC细胞（图6F）。综上所述，这些结果证明了circCRKL通过调控miR-877-5p介导的BCR-ABL促进CML细胞增殖。

图6 circCRKL吸收miR-877-5p增强BCR-ABL，加速CML细胞增殖

7. 当circCRKL被敲除时，K562/G01细胞对伊马替尼更敏感

考虑到伊马替尼耐药细胞株K562/G01的circCRKL表达水平高于K562细胞，推测circCRKL与伊马替尼耐药性之间可能存在联系。CCK-8法测定K562或K562/G01细胞对伊马替尼的半最大抑制浓度值（IC-50）（图S2A）。随后，检测稳定敲低circCRKL和circCRKL野生型K562/G01细胞经伊马替尼处理48 h后的细胞活力并计算IC-50值。数据表明，circCRKL沉默显著降低了细胞活力，并且IC-50值同时降低（图S2B）。流式细胞仪显示，敲低circCRKL可促进伊马替尼处理的K562/G01细胞的凋亡（图S2C）。抑制或过表达miR-877-5p对K562/G01细胞IC-50值没有明显影响（图S2D）。之前的研究已经将Wnt通路与伊马替尼耐药联系在一起，相应的，相关标志物包括CTNNB1和c-Myc也通过western blot检测。数据表明，在circCRKL敲低的K562/G01细胞中，CTNNB1和c-Myc均有明显缺失（图S2E）。综上所示，circCRKL可能通过介导Wnt/β-catenin信号通路调控K562/G01细胞对伊马替尼的敏感性。

图S2 circCRKL敲低可改善伊马替尼耐药细胞株K562/G01的敏感性

结论：

该研究揭示了由CML相关基因CRKL生成的circCRKL通过吸附miR-877-5p来维持BCR-ABL的表达水平，从而促进CML细胞增殖（图6G），揭示了circCRKL在伊马替尼耐药细胞中发挥关键作用（图S2），这为缓解CML患者的耐药提供了一个新的视角。然而，circCRKL参与伊马替尼耐药的分子基础仍需进一步研究。总之，circCRKL可以引领CML治疗靶点的进展。