褪黑激素改善帕金森病

帕金森病(PD)的一个重要病理生理成分是昼夜节律紊乱，与循环褪黑激素(MLT)水平下降密切相关。近年来有报道称维甲酸相关孤核受体(RORα)是MLT潜在的内源性配体，在多种疾病中发挥着重要作用。然而，RORα在神经退行性疾病发病机制中的作用尚不清楚。在这里，我们通过一个细胞PD模型显示，在MPP+处理的BV2细胞中，RORα表达下调，而MLT处理后上调。在MPTP诱导的小鼠模型中，中脑组织中RORα水平降低，MLT处理显著提高了RORα水平，保护了多巴胺神经元。此外，siRNA介导的下调暗示了STAT通路的参与。总之，MLT通过抑制STAT相关的小胶质细胞的促炎极化来改善神经炎症，为PD的神经保护治疗提供了替代方案。本文于2022年7月发表于“NPJ Parkinson’s Disease”（IF=9.304）上。

技术路线

结果

1）RORα在MPP+处理的BV2细胞中表达下调

为探讨RORα是否参与PD的炎症过程，我们首先研究了不同浓度(0-100 μM)的MPP+对BV2细胞的生物学作用。结果显示50 μM MPP+诱导的BV2细胞活力下降25-30%(补充图，未展示)。RT-qPCR和WB分析显示，MPP+-处理的BV2细胞中，低剂量(10和20 μM) MPP+处理后，RORα的表达增加，但在高剂量(50 μM)时显著降低(图1a-c)。我们还观察到，随着MPP+浓度的增加，促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)逐渐增加，而IL-10等抗炎因子逐渐减少(图1d)。RORα表达的改变与细胞因子水平的改变提示RORα在PD中具有抗炎症作用。

2） MLT在体外增加RORα表达，抑制促炎性M1样小胶质细胞极化，减少神经炎症

我们探索了MLT对MPP+处理的BV2细胞的潜在抗炎机制。RT-qPCR和WB分析表明，MLT（50μM）完全逆转了MPP+在50μM时诱导的RORα的降低，尽管最终水平低于单独使用MLT（图2a-c）。同时，ELISA检测到MLT处理后抗炎细胞因子IL-4和IL-10水平升高，促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）浓度显著降低（图2d），进一步证实了MLT在MPP+处理的BV2细胞中的抗炎作用。此外，在PD的进展过程中，小胶质细胞极化在神经炎症发病机制中起着重要作用。因此，我们进一步分析了MLT对细胞模型中小胶质细胞分化的影响。在应用MPP+前半小时应用MLT，并在药物干预后24小时通过RT-qPCR测量极化标志物。结果表明，MLT治疗降低了促炎分子（如iNOS、CD36、IL-1β、TNF-α）以及DAM表型因子如TREM2和TLR4的基因表达，但增加了抗炎M2样标记物CD206和ARG-1的表达（图2e-g）。这些结果表明，RORα通过减少小胶质细胞中促炎性M1和DAM表型标记物的表达，在MLT的抗炎作用中发挥作用。

3）MPTP处理的小鼠中RORα表达降低，且MLT显示出减轻MPTP的抗炎作用

为了研究RORα与体内PD之间的关系，我们使用MPTP诱导的PD小鼠模型。与体外结果一致，MPTP处理的小鼠的中脑组织RORα水平下调（图3a-c）。为了探讨MLT在体内是否具有相同的抗炎作用，在MPTP注射前半小时注射MLT。我们观察到，与对照组相比，MLT治疗组的小鼠在运动功能方面表现更好（未展示）。MLT治疗后，炎症因子（包括IL-6、IL-1β、TNF-α）的血清水平降低，而抗炎因子（如IL-4和IL-10）显著增加（图3d）。此外，免疫荧光显示MLT处理可防止TH阳性细胞在SNc中丢失（图3e，f）。这些结果表明，MLT对DA神经元具有抗炎和保护作用，从而改善MPTP诱导的小鼠模型的运动症状。

4）MLT增加MPTP处理小鼠的RORα水平，并降低促炎和DAM相关基因表达

我们观察到，MLT治疗显著增加了中脑组织的RORα水平（图4a-c）。RORα的免疫组织化学染色图像显示了类似的结果（图4d，e），表明MLT的作用可能与RORα有关。此外，我们研究了MLT是否能改变MPTP诱导的小鼠的小胶质细胞表型。MPTP和MLT+MPTP处理组的小胶质细胞均因IBA-1的增加而激活。RT-qPCR检测发现，促炎M1样和DAM表型标记物减少，而抗炎M2样表型分子增加(图3g-i)。类似地，MLT处理组中IBA1+iNOS+细胞的荧光强度小于MPTP组，而MLT+MPTP组中IBA1+ARG-1+细胞的荧光强度高于MPTP组（图4f，g）。总之，MLT处理通过下调促炎和DAM相关分子改变了小胶质细胞表型。

5）RORα缺失促进小胶质细胞促炎表型极化，加重神经炎症

据报道，RORα可在多种疾病中发挥抗炎作用。为了验证RORα在MLT对MPP+处理的BV2细胞的影响中是否发挥了类似的作用，我们进一步确定了RORα缺失对小胶质细胞极化和炎症的分子效应。SiRNA用于敲除RORα。此外，在MPP+干预前，我们还使用了SR3335，一种合成的RORα选择性逆激动剂，和SR1078，一种合成的RORα激动剂。在蛋白质水平上，与MPP+处理组相比，MLT和SR1078处理组均显示出抗炎作用。然而，SR3335并未增加MPP+处理细胞中TNF-α的水平或降低IL-10的水平。更重要的是，与MLT+MPP+的非沉默组相比，RORα敲除增加了培养基中促炎因子（TNF-α和IL-1β）的水平，并降低了抗炎因子（IL-10）（图5a）。同时，免疫荧光图像显示的iNOS的上调和ARG-1的下调也表明，BV2细胞中的RORα缺失可增强促炎极化（图5b，c）。在mRNA水平上，RT-qPCR显示出一致的结果，但MLT处理细胞组中ARG1表达除外。MLT+MPP+处理的细胞显示免疫染色强度增加，但ARG-1的mRNA减少（图5d）。这些结果表明RORα参与了MLT的抗炎作用。

6）MLT通过STAT的RORα依赖的信号通路调节小胶质细胞极化

据报道，MLT的抗炎作用与STAT通路的激活有关。为了进一步探索与MPP+诱导的神经炎症和MLT介导的抗炎相关的信号通路，我们检测了关键信号分子STAT的表达和磷酸化，尤其是STAT1和STAT3。结果表明，在MPP+刺激的BV2s中，p-STAT1的表达增加，而p-STAT3的表达显著降低。MLT预处理抑制p-STAT1的表达，但激活STAT3磷酸化。为了验证RORα是否参与MLT对STAT通路的影响，使用siRNA来敲除RORα。与没有RORα-siRNA的细胞组相比，RORα的缺乏显著降低了p-STAT3的水平，但增加了MLT预处理引起的STAT1的磷酸化（图6a，b）。这些结果表明MLT通过RORα-STATs途径介导小胶质细胞的表型变化。

结论：本研究证明MLT通过改变小胶质细胞的表型标志物减轻神经炎症。MLT调节小胶质细胞向抗炎表型转变，且RORα在小胶质细胞极化的调节中发挥关键作用。该发现指出了MLT-RORα轴的有益作用，其可减少炎症反应并改善PD。

参考文献：

Li J, Liu H, Wang X, Xia Y, Huang J, Wang T, Lin Z, Xiong N. Melatonin ameliorates Parkinson's disease via regulating microglia polarization in a RORα-dependent pathway. NPJ Parkinsons Dis. 2022 Jul 8;8(1):90. doi: 10.1038/s41531-022-00352-5.