PDX1、EN2和MSX1高甲基化可预测结直肠癌的预后

大量研究表明DNA甲基化改变与癌症进展之间的关系，但只有少数基因被证实可作为结直肠癌（CRC）的诊断生物标志物。近日，有研究发现PDX1, EN2和MSX1的高甲基化可以预测结直肠癌患者的预后，该研究发表在《Experimental & Molecular Medicine》，IF：12.125。

技术路线：

主要研究结果：

1. 通过靶向亚硫酸氢盐测序鉴定CRC组织中的差异甲基化区域

为了观察CRC和其他类型癌症中的甲基化水平，从TCGA收集了5种癌症类型（COAD、READ、LIHC、AD和PAAD）的微阵列数据（图1a）。根据人类基因组ref. （hg19）将每个CpG位点的beta值取平均值，以代表其匹配的CpG岛的甲基化值。根据一下标准进一步过滤所选择的CpG岛：健康组织和肿瘤组织之间的甲基化值差异应该大于20%； 20%的癌症患者应该存在这种差异。最终获得了10,754个差异甲基化的CpG岛（图1b）。作者使用NimbleDesign软件设计选定的CpG岛来探测池 （图1c）。

从104例韩国CRC患者的组织中获得了基因组DNA，根据制造商说明书制备靶向亚硫酸氢盐测序文库（图1d）。为了识别一些患者不特异的差异甲基化区域，在计算健康组织和肿瘤组织的总体平均值后，选择差异超过30%的区域（图1e）。最终在肿瘤组织中鉴定出40个差异甲基化的CpG岛，包括35个高甲基化区域和5个低甲基化区域。健康组织中平均甲基化水平为29%，肿瘤组织中为78.7%，在83.3%的CRC患者中观察到这种差异（表1）。

图1结直肠癌队列特异性DNA甲基化生物标志物选择的总体流程

表1列出了从90例结直肠癌患者的靶向亚硫酸氢盐测序数据中选择的候选CpG岛及其匹配的基因，并提供了有关CpG岛及其邻近基因的基因组和功能位置信息。

2. 候选基因的选择，以发展结直肠癌生物标志物

根据启动子、基因内和基因间区域观察40个差异甲基化CpG岛的位置时，作者观察到在肿瘤的35个高甲基化区域中，16个CpG岛位于启动子区域，18个位于基因内区域，1个位于基因间区域。在5个低甲基化区域中，1个在启动子区域，4个在基因内区域（图2a和表1）。此外，在18个高甲基化的基因内区域中，有7个基因（PDX1、GRIN2D、PITX1、TFAP2A、EN2、MSX1和NR2E1）在肿瘤中表达增加了2倍以上（图2b）。为了确定这7个基因的上调水平，作者还在TPM值上检查了其他候选基因的表达，然后剔除了NR2E1，因为它缺乏统计学意义（图2c）。此外，相关性检测分析发现PDX1、EN2和MSX1在肿瘤中的表达水平高于正常组织，且甲基化和表达水平呈正相关（图2b、c）。通过检测基因的表达与CRC患者生存率之间的关系，发现PDX1、EN2、MSX1的高表达与患者生存呈负相关（图2d）。因此，后续决定集中研究这三个基因。

图2基于差异基因表达及其与CRC患者生存结局相关性的候选DNA甲基化生物标志物基因

3. PDX1、EN2或MSX1过表达促进人结肠癌细胞增殖和侵袭

功能分析实验表现，过表达PDX1、EN2和MSX1增加了癌细胞增殖（图3a），显著促进HCT116细胞的迁移（图3b），这些结果表明PDX1, EN2和MSX1的过表达与CRC细胞的增殖和迁移直接相关。因此，作者推测如果这些基因的基因内区域的甲基化变化与基因表达的变化相关，那么检测标记区域的甲基化变化将能够预测细胞状况。

图3筛选出的候选DNA甲基化生物标志物基因通过促进细胞增殖和迁移来驱动体外致癌特性

4. 设计MSP引物以最佳检测甲基化变化

为了设计针对PDX1基因内CpG岛的MSP引物，作者检测了该区域80个单个CpG位点的甲基化变化。虽然大多数CpG位点在肿瘤组织和健康组织之间的甲基化变化有很大差异，但最终根据候选CpG岛中每个CpG位点的甲基化水平的热图和线形图设计了MSP引物（图4a）。PDX1正向引物有4个CpG位点，反向引物有3个CpG位点。这7个CpG位点的β值在正常组织中约为10%，而在肿瘤组织中平均为70%。扩增子大小为126 bp和123 bp, Tm为55-57℃（图4a）。EN2的正向引物和反向引物都有三个CpG位点。6个CpG位点的β值在正常组织中约为10%，而在肿瘤组织中平均为70%。扩增子大小分别为127 bp和112 bp, Tm为57-58℃（图4b）。MSX1正向引物和反向引物均有3个CpG位点。6个CpG位点的β值在正常组织中约为10%，而在肿瘤组织中平均为70%。扩增子大小分别为151 bp和144 bp, Tm为55-57℃（图4c）。

图4甲基化特异性PCR （MSP）中引物结合位点选择和引物设计的优化基准

5. MSP引物可有效检测感兴趣区域的甲基化状态

在每个CpG岛，甲基化引物在SW480、LoVo和HCT116细胞中均产生PCR产物，而在CCD-18Co细胞中未产生PCR产物。相反，在CCD-18Co细胞中检测到未甲基化的引物，而在SW480、LoVo和HCT116细胞中未检测到。半甲基化引物未能在CCD-18Co、SW480、LoVo和HCT116细胞中显示出明显的差异（图4d-f）。当我们作者甲基化引物时，SW480、LoVo和HCT116细胞的甲基化水平显著高于CCD-18Co细胞，而使用半甲基化引物时则没有（图4d-f）。此外，通过qMSP观察了CCD-18Co和SW480细胞的差异甲基化水平，发现对于PDX1，即使是0.5 ng的模板DNA也足以观察到这种差异（图4g-i）。从这些结果证实了MSP引物可以非常有效地区分癌细胞和正常细胞。

6. 建立的MSP引物可以检测甲基化状态的动态变化

为了检测MSP引物是否可以区分甲基化水平的动态变化，作者使用CRISPR/dCas9-TET1系统（dCas9-TET系统）以位置特异性的方式降低甲基化水平（图5a）。在将dCas9-TET系统引入PDX1基因组区域后，使用包含7个CpG位点的甲基化引物检测到甲基化水平显著降低。然而，半甲基化引物无法检测到这一差异（图5b）。随着基因内区域甲基化水平的降低，PDX1的表达显著降低，表明甲基化的变化与基因表达的变化直接相关（图5c），且EN2和MSX1得到了相似的结果。使用甲基化引物，能成功检测到EN2和MSX1基因内区域的甲基化水平降低，这与基因表达的降低一致（图5d-g）。因此，甲基化引物可以检测到在基因表达变化之前发生的甲基化变化。

图5定制的MSP引物检测由CRISPR/dCas9-gRNA系统调控的SW480候选生物标志物的甲基化变化

7. PDX1、EN2和MSX1的甲基化水平预测结直肠癌转移

接下来，作者研究了PDX1、EN2和MSX1的基因内CpG区域的甲基化水平是否具有临床意义。作者利用曼哈顿距离进行层次聚类，根据这些区域的甲基化水平对患者进行分类，得到两个组：高甲基化组（组1,N = 26），中间甲基化和低甲基化组（组2,N = 61）（图6a）。这两组在OS（图6b）和PFS率（图6c）方面存在显著差异。此外，周围淋巴、血管和神经侵犯是肿瘤转移后的特征性事件，这些事件在组1中发生率高于组2。然而，未观察到细胞分化、微卫星不稳定性和肿瘤位置的差异，因为大多数IV期（转移后）患者被纳入组1，而大多数III期（转移前）患者被纳入组2（表2）。这些结果表明，PDX1, EN2和MSX1甲基化水平可以预测CRC患者的预后。

最后，研究MSP系统是否可以区分这两个患者组。与组2中的5例患者相比，组1中的2例患者在PDX1、EN2和MSX1的基因内区域显示出更高的甲基化水平（图6d）。该结果表明，MSP检测系统可用于临床预测结直肠癌患者的预后和术后转移。

图6通过对CRC患者的分类显示了3个基因甲基化标签的预后潜力

表2 根据PDX1、EN2和MSX1基因内CpG岛甲基化水平分组，收集临床资料

结论：

在这项研究中，作者提出了一种识别CRC预后标志物的实用方法。作者利用公共数据库并生成合适的高深度靶向亚硫酸氢盐测序数据来定义韩国东南部特异性差异甲基化区域（DMRs）。此外，在体外验证了PDX1, EN2和MSX1基因内CG基因的增殖能力，并提出了优化的qMSP方法，以进一步应用于临床领域。基于队列患者的随访数据，作者发现靶向CGI高甲基化的CRC患者的OS显著降低，复发率较高。除了手术活检、辅助化疗和其他适当治疗外，定期追踪预后因素可能对晚期CRC患者有帮助。