抑制肝癌的咽喉，还得看circRNAs的表演

大量的研究表明circRNAs可以通过与结合蛋白相互作用、海绵化miRNAs和调节蛋白翻译来实现基因调控。但是circRNA是如何通过m6A修饰形成一个反馈环从而导致肝癌的机制还没有相关文献说明。本研究证明circGPR137B通过circGPR137B/miR-4739/FTO反馈环路抑制肝癌的发生和转移。本研究于2022年6月发表在《Molecular Cancer》IF：41.444期刊上。

技术路线：

主要研究结果：

1、  circGPR137B下调与HCC患者预后不良相关

对3对肝癌组织样本进行了circRNA表达谱分析。与癌旁正常组织相比，热图显示HCC组织中，鉴定出96个上调的circRNA和51个下调的circRNA (图1B )。火山图显示，has-circ-0017114，一个来源于线性RNA GPR137B的circ RNA，在HCC中呈表达下调，命名为circGPR137B (图1C )。circRNA图谱和RT-qPCR显示，与癌旁正常组织相比，HCC中circGPR137B表达降低（图1D-1E）。预后分析发现与circGPR137B高表达组比较，circGPR137B低表达组具有较差的生存预后（图1H-1I）。以上结果表明circGPR137B下调和HCC患者的不良预后相关。

图1 circGPR137B下调与HCC患者不良预后相关

2、  circGPR137B在HCC中的特征

has-circ-0017114位于染色体14q1，由G蛋白偶联受体137B ( GPR137B )位点第1、7外显子区衍生而成。HepG2和Hep3B细胞在RNase R处理2h后，GPR137B的表达水平显著下降，而circGPR137B中在HepG2和Hep3B细胞中，由于其对RNase R的抗性，circGPR137B没有明显的变化(图2B )。作者随后考察了在指定时间点暴露于转录抑制剂放线菌素D后，circGPR137B的稳定性。发现，在HepG2和Hep3B细胞中，circGPR137B的转录半衰期显著远长于线性GPR137B（图2C）。qPCR和FISH分析表明，与线性GPR137B（图2D-2E）相比，circGPR137B主要定位于HCC组织的染色细胞质中。

图2 circGPR137B在肝癌细胞中的特征

3、  在体外，circGPR137B抑制HCC细胞的生长和侵袭

研究检测了6株HCC细胞系中circGPR137B的表达，作者通过qRT-PCR分析，估计了circGPR137B在多个HCC细胞系中的表达情况，结果显示，与正常肝组织相比，circGPR137B在SK-hep-1细胞系中高表达，而在HepG2和Hep3B细胞系中低表达（图3A）。后续在SK-hep-1细胞系中进行circGPR137B的敲低实验，在Hep3B中进行circGPR137B过表达实验（图3B）。MTT，集落形成和Transwell实验显示circGPR137B过表达HCC细胞的生长和侵袭，circGPR137B敲低则效果相反（图3C-3E）。以上表明circGPR137B在HCC中发挥抑癌作用。

图3 circGPR137B抑制体外细胞生长和侵袭

4、  在HCC中miR-4739的表达和circGPR137B负相关和HCC不良预后相关

根据circRNA表达谱和miRbase数据库鉴定， circGPR137B具有与5个miRNA结合的潜力(图4A )，其结合位点如图4B所示。作者们分析了hepG2细胞中5个miRNA mimics处理后的circGPR137B的荧光素酶活性，发现相比其他miRNA，miR-4739显著降低了circGPR137B的荧光素酶活性(图4C )。FISH分析显示miR-4739表达水平显著升高（图4D-4E），且与circGPR137B呈负相关（图4F）。TCGA数据也证实miR-4739表达在HCC中显著上调，且和不良预后相关（图4G-4H）。以上说明HCC中miR-4739高表达且预示不良预后。

图4 miR-4739与circGPR137B和肝癌预后不良呈负相关

5、  circGPR137B在肝癌中充当miR-4739的海绵

在HepG2和Hep3B细胞中circGPR137B异位表达可降低miR-4739的表达(图5B )，而miR-4739模拟物对circGPR137B的表达无影响。将野生型或变异型circGPR137B 3′UTR的PRL- TK-p MIR-Luc载体与miR-4739模拟物共转染HepG2和Hep3B细胞，结果显示，miR-4739 mimics降低了野生型circGPR137B 3′UTR的荧光素酶活性，但对变异型circGPR137B 3′UTR的荧光素酶活性没有影响，变异型miR-4739也对HepG2和Hep3B细胞中野生型circGPR137B 3′UTR的荧光素酶活性没有影响（图5C）。此外，根据一个在线循环RNA相互作用组，指出了Ago2在circGPR137B区域的占有率。RIP检测进一步的证明，与输入对照相比，Ago2颗粒中表达Ago2的HepG2和Hep3B下调的内源性circGPR137B和miR-4739的富集显著提高了（图5D）。此外，在HepG2细胞中，通过FISH分析发现circGPR137B与miR-4739之间存在胞质共定位（图5E）。将circGPR137B慢病毒与HepG2和Hep3B细胞中的miR-4739模拟物共转染，结果显示miR-4739促进细胞增殖和侵袭，并抵消了circGPR137B的抑瘤作用（图5F-5G）。

图5 circGPR137B在肝癌中充当miR-4739的海绵

6、FTO受circGPR137B/miR‑4739轴调控，提示肝癌预后良好

miR-4739模拟物可降低野生型FTO 3'UTR的荧光素酶活性，但对变异型FTO 3'UTR没有影响，与miR-NC组相比，变异型miR-4739对HepG2和Hep3B细胞野生型FTO 3'UTR的荧光素酶活性没有影响（图6B）。此外，qRT-PCR和Western Blot分析表明，miR-4739模拟物显著降低FTO、p21、p27、cleaved caspase-3/9和E-cadherin的表达，增加N-cadherin和vimentin的表达（图6C-6D）。将FTO质粒与miR-4739模拟物共转染HepG2和Hep3B细胞48 h后，发现FTO的异位表达阻止了细胞增殖、集落形成和细胞侵袭，逆转了miR-4739的促瘤作用（图6E-6G）。这些证实了m6A脱甲基化酶FTO可能是miR-4739的靶点（图6A）。

根据RT-qPCR和Western Blot分析，与癌旁正常组织（图7A-7B）相比，10份HCC组织样本FTO的表达显著降低。在50对配对和371对未配对的肝癌组织中验证了这一结果（图7C）。然后，作者发现FTO表达下降与HCC的年龄和远处转移有关。Kaplan-Meier生存分析显示，FTO高表达组的生存率明显高于低表达组（图7D）。即：FTO表达在HCC组织中显著下降，且FTO下调与HCC预后不良有关。

图6 在HCC中，FTO受circGPR137B/miR-4739轴调控。

图7 FTO下调提示肝癌预后不良。

7、FTO介导m6A修改circGPR137B形成一个具有circGPR137B的正反馈环

作者推测FTO介导的m6A修饰的circGPR137B可以抑制HCC的进展。MeRIP和m6A斑点杂交表明，FTO过表达降低了HepG2和Hep3B细胞的总m6A水平和circGPR137B m6A水平（图8A-8C），但增加了circGPR137B RNA水平（图8D）。敲除FTO可降低circGPR137B的表达（图8E）。随后，干扰circGPR127B使miR-4739表达增加，FTO表达下调（图8F），反之，FTO表达增加（图8G）。RIP实验证实FTO可与HCC细胞中的circGPR137B结合（图8H）。然而，FTO对GPR137B m6A水平没有影响，不能与GPR137B结合。进一步的功能研究表明，敲低circGPR137B能够促进HepG2和Hep3B细胞的增殖和侵袭，并抵消FTO诱导的HepG2和Hep3B细胞（图8I-8J）的抗肿瘤作用。

图8 FTO介导m6A修饰的circGPR137B与之形成正反馈回路

8、circGPR137B抑制体内肝癌的发生和肺转移

将稳定转染circGPR137B或pcDNA3.1的荧光素酶标记的HepG2细胞注射到裸鼠体内。采用活体成像检查荧光素酶信号，结果显示，circGPR137B组肿瘤组织的荧光素酶信号较对照组弱（图9A）。而且circGPR137B组的肿瘤似乎比对照组小。统计学分析表明circGPR137B组肿瘤体积和重量均减小（图9B-9C）。HE染色显示肿瘤细胞数量减少，免疫组化分析显示，与对照组相比，circGPR137B组Ki-67和FTO水平更低（图9D）；qRT-PCR分析进一步显示，与对照组相比，过表达circGPR137B组miR-4739表达降低，FTO表达升高（图9E）。在体内阻断circGPR137B对肿瘤生长有促进作用（图9F）。免疫组化分析显示，与对照组相比，sh-circGPR137B组Ki-67水平升高，FTO水平降低（图9G）；qRT-PCR分析进一步显示，与对照组相比，sh-circGPR137B组miR-4739表达升高，FTO表达降低（图9H）。

采用活体成像检查荧光素酶信号，结果显示肝脏肿瘤生长伴腹膜转移。circGPR137B组荧光素酶信号较对照组明显减弱（图10A）。circGPR137B组小鼠肝脏肿瘤的大小出现小于对照组的情况，与对照组相比，circGPR137B组小鼠体重不变但肝脏重量减轻（图10B）。此外，尾静脉注射稳定转染circGPR137B或CON的HepG2细胞建立肺转移模型。作者发现，circGPR137B组转移性肺肿瘤的形成率较对照组肺重量减轻（图10C）。HE染色显示，circGPR137B组原位肝肿瘤和肺转移瘤细胞数量减少，IHC分析显示，circGPR137B组肝脏肿瘤和肺转移瘤组织Ki-67指数降低，FTO表达升高（图10D）；qRT-PCR显示，与对照组相比，circGPR137B过表达使原位肝肿瘤miR-4739表达降低，FTO表达升高（图10E）。综上所述，circGPR137B能够抑制体内肝癌的发生和肺转移。

图9 circGPR137B抑制体内肝癌的发生

图10 circGPE137B抑制体内肝癌肺转移

结论

研究结果证明，circGPR137B通过与FTO mRNA结合的miR-4739海绵诱导FTO蛋白表达，以抑制其表达。FTO蛋白进入细胞核，介导circGPR137B的m6A去甲基化，促进其表达。因此，circGPR137B产生正反馈，从而强烈抑制肝癌细胞增殖、集落形成、侵袭和肺迁移。本研究为circRNA和m6A修饰形成的反馈环路提供了直接证据，从而对表观遗传学产生了新的见解。

图11 本研究的机制模拟图

参考文献

Liu L, Gu M, Ma J, Wang Y, Li M, Wang H, Yin X, Li X.(2022). CircGPR137B/miR-4739/FTO feedback loop suppresses tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Mol Cancer. 21(1):149. doi: 10.1186/s12943-022-01619-4.