增殖性糖尿病视网膜病变：仅仅分析了GEO中的两个数据集就发了6分文章！

为探索增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）进程中的相关免疫机制，作者通过分析GEO中两个数据集（GSE60436和GSE102485），发现PDR和正常视网膜的纤维血管膜（FVM）中免疫细胞浸润存在显著差异。FVM中滤泡性辅助T细胞、M2巨噬细胞的比例显著增加。此外，作者还发现了五个与M2巨噬细胞相关的基因，分别是COL5A2, CALD1, COL6A3, CORO1C和CALU。这些基因在PDR中高表达且可作为PDR的潜在标记物。本文于2022年5月发表在《Front Endocrinol (Lausanne) 》，IF=6.06。

技术路线图

主要结果

1）研究设计与数据处理

如图1所示，差异基因分析和共表达分析的综合分析结果表明免疫细胞（特别是M2型巨噬细胞）在DR进展中发挥重要作用。进一步，FVM中的COL5A2, CALD1, COL6A3, CORO1C, and CALU可能是PDR的潜在M2巨噬细胞相关的生物标志物。本研究选取的GSE60436数据集基于GPL6884（Illumina Humanwg-6 v3.0表达微珠芯片）的平台，其中包括3个正常的视网膜组织和6个FVM组织。本研究的第二个数据集GPL18573基于GPL18573平台（Illumina NextSeq 500），包含20个FVM（17例来自于2型糖尿病和3例来自于1型糖尿病患者），3个正常视网膜样品和其他7个样品。如图2A所示，结果内部校正和归一化后，消除了2个不同数据集之间的批次效应。最终，作者从两个数据集中选择了32个合格的样品（6个正常视网膜和26个FVM）和14,132个交集基因进行后续分析（图2B）。接下来，在对两组之间的生物学差异的主要分析中，GSEA表明免疫功能的多个标志与FVM呈正相关，包括IL2-STAT5、IL6-JAK-STAT3信号通路、IFN-α、IFN-γ以及通过NF-κB传导的TNF-α通路。其他高度富集的标志包括血管生成，凋亡和上皮间质转变等（图2C）。这些结果初步表明了PDR中免疫活性与FVM之间的相关性。

图1. 流程图展示本研究的设计过程。

图2 数据预处理和GSEA分析。

2）FVM和正常视网膜的免疫景观

采用CIBERSORT计算32个样品（26个FVM和6种正常视网膜）中22种类型的免疫细胞的浸润。箱式图展示了29个合格样品中22种免疫细胞类型的比例（图3A）。图3B展示了免疫细胞之间的相关性。其中静止的肥大细胞和浆细胞之间表现出最强的正相关性（r = 0.6），而浆细胞和M1巨噬细胞之间的最强负相关性（r = -0.55）。两组之间的免疫细胞浸润比例差异如图3C所示。与对照组相比，FVM组中滤泡辅助T细胞，M1巨噬细胞和M2巨噬细胞的百分比显着增加，而浆细胞，活化的NK细胞和静息肥大细胞的百分比显著降低。如图3D所示，FVM和正常视网膜组之间的完全分离表明，免疫细胞类型的浸润可以用作PDR患者FVM的区别特征。

图3. FVM和正常视网膜组织中的免疫浸润景观。

3）鉴定PDR浸润免疫细胞相关基因

通过WGCNA分析基因表达数据和免疫细胞类型。如图4A所示，作者建立了一个无标度拓扑网络(soft-thresholding power=5, scale-free R2 = 0.9)。基于层次聚类方法，将高度共表达的基因聚类为不同的模块和颜色编码（图4B）。在合并高度相关的模块后，总共确定了28个包含14,132个基因的模块（图4B，C）。代表该模块中所有基因的表达的ME与三种选定类型的免疫细胞的特征有关。其中，作者将与M2巨噬细胞最紧密相关的蓝色模块（r = 0.81，P = 1E-07）为hub模块（图4C，D）。该模块包含718个基因，其中14个基因kME>0.9，被认为是hub基因，并且可能起着重要的病理学作用。GO富集分析表明这14个基因与多个富含组织重塑过程和纤维化的条目相关。生物学过程（BP），分子功能（MF）和细胞成分（CC）中的前10个重要条目如图4E所示，包括肌动蛋白丝组织，细胞外基质组织，肌动纤维和肌动蛋白结合等。这些数据表明这些hub基因通过调节M2巨噬细胞影响PDR进展。

图4. 通过WGCNA鉴定免疫细胞相关基因。

4）探索M2巨噬细胞相关生物标志物。

为了鉴定可能促进PDR发展的基因，作者分析了所有32个样品的基因表达数据。对比FVM和正常视网膜组后发现674个差异表达的基因（328个上调和346个下调）（图5A）。将差异表达和M2巨噬细胞相关的基因取交集后一共获得5个基因，分别是COL5A2, CALD1, COL6A3, CORO1C和CALU（图5B）。对这5个基因进行GO功能富集分析后发现，最高的GO条目划痕愈合和组织修复等过程有关（图5C），并且这些条目的富集与M2巨噬细胞的功能一致。此外，FVM组中这五个基因的表达显著高于对照组（图5D）。PCA结果显示，整体数据集乃至单个数据集中的FVM样品和正常视网膜样品之间的完全分离（图5E）。

图5. M2巨噬细胞相关的生物标志物的鉴定。

参考文献

Zhishang Meng, Yanzhu Chen, Wenyi Wu, Bin Yan, Yongan Meng, Youling Liang, Xiaoxi Yao, Jing Luo. Exploring the Immune Infiltration Landscape and M2 Macrophage-Related Biomarkers of Proliferative Diabetic Retinopathy. Front Endocrinol (Lausanne). 2022 May 27;13:841813. doi: 10.3389/fendo.2022.841813. eCollection 2022.