CircSV2b通过miR-5107-5p-Foxk1-Akt1轴参与帕金森病的氧化应激调节

研究表明，circRNAs的失调与神经疾病有关。然而，帕金森病（PD）中circRNAs的生物发生、调节、功能和机制仍不清楚。在这项研究中，通过对MPTP诱导的PD小鼠和野生型小鼠进行RNA测序，检测出了33种差异表达的circRNAs（DECs）。实时定量PCR检测纹状体（STR）、黑质致密部（SNpc）和血清外泌体中DECs的RNA水平，发现PD小鼠中circSV2b下调。然后，通过体内功能实验，探讨circSV2b对PD的影响，机制研究发现circSV2b直接海绵化miR-5107-5p并减轻对靶基因Foxk1表达的抑制，然后正调控Akt1转录。在体内， circSV2b过表达通过ceRNA-Akt1轴抵抗氧化应激损伤。综上所述，这些发现表明miR-5107-5p-Foxk1-Akt1轴可能是PD治疗中circSV2b过表达的关键靶点，并强调了血清外泌体中circSV2b的显著变化。因此，circSV2b可能是PD诊断和治疗的生物标记物。本文于2022年8月发表于“Redox Biology”（IF=10.787）上。

技术路线

结果

1）MPTP成功诱导小鼠PD的发生

我们连续5天腹腔注射MPTP溶液，以建立PD小鼠模型。MPTP降低了STR中DA及其代谢物（DOPAC和HVA）的水平（图1A-C）。爬杆实验和步态分析均表明，MPTP治疗会损害小鼠的运动平衡（图1D-F）。MPTP治疗降低了SNpc和STR中TH的表达，并损伤了多巴胺能神经元（图1G-J）。这些结果表明，MPTP减弱多巴胺合成，破坏黑质纹状体功能，并诱发PD的运动症状。

2）MPTP诱导的PD小鼠的circRNA谱分析

RNA测序分析表明，在PD小鼠中发现8个上调和25个下调的circRNAs（图2A）。这33个circRNAs在STR组织中的存在通过qRT-PCR进行了验证。结果表明，在25个下调的circRNAs中，14个下调，8个上调，2个不变，1个未检测到；在8个上调的circRNA中，5个上调，2个下调，1个未检测到（图2B）。在SNpc和血清外泌体中评估了19个RNA-seq数据(STR中)与qRT-PCR结果(STR中)一致的circRNAs(图2C)。CircRNA#3，即circSV2b，其RNA测序（STR中）和qRT-PCR验证（STR、SNpc和血清中）结果一致，被选为本研究的目标（图2C）。FISH进一步证实，MPTP处理后，SNpc和STR中的circSV2b表达下调（图2D）。CircSV2b来源于小鼠chr7（qD1）上的SV2b基因，由外显子5–9在转录后通过头尾剪接形成（图2E）。此外，我们设计了SV2b mRNA的收敛引物和扩增circSV2b的特殊发散引物。我们在cDNA中检测到一个320 bp的circv2b产物，在提取的gDNA中检测到一个950 bp的产物(图2F)。我们使用RNase R来验证circSV2b的稳定性，发现circSV2b对RNase R消化有抵抗力（图2G）。我们通过Sanger测序证实了circSV2b RT-PCR产物中circSV2b的头尾拼接（图2H）。

3）过表达circSV2b改善MPTP诱导的小鼠PD症状

我们评估了circSV2b过表达对PD的保护作用。注射AAV导致circSV2b过表达，并且在MPTP治疗后，circSV2表达仍然很高（图3A）。爬杆实验和步态分析都表明，circSV2b的过表达减轻了受损的运动平衡（图3B）。circSV2b过表达部分恢复了SNpc和STR中MPTP诱导降低的DA水平和TH蛋白水平（图3C-E）。circSV2b过表达也逆转了SNpc中TH+神经元数量和STR TH+纤维密度的减少（图3F和G）。这些结果表明，circSV2b过表达可恢复多巴胺合成，维持黑质纹状体功能，并改善MPTP诱导的PD小鼠的运动功能。

4）circSV2b通过ceRNA机制发挥作用

为了探索circSV2b的亚细胞定位，我们使用N2A细胞进行FISH染色，并证明circSV2位于N2A细胞的细胞质中（图4A）。然后我们在组织水平上进行了测试。结果表明，circSV2b主要位于SNpc的细胞质中，MPTP处理导致细胞质circSV2b显著减少（图4B）。为了证明circSV2b与AGO2的结合作用，我们进行了荧光共标记实验。结果表明，circSV2b和AGO2共定位（图4C）。我们分析了3种circRNA-miRNA预测工具（miRanda、TargetScan和RNAhybrid）的重叠结果，确定了13种miRNAs（图4D）。miRTarBase工具用于预测miRNA靶基因；只有3个候选miRNAs具有下游靶基因（图4E）。我们比较了MPTP治疗后SNpc组织中候选miRNAs的水平。结果表明，与其他候选miRNAs相比，MPTP组miR-5107-5p的增加更为显著（图4F）。进一步使用抗AGO2抗体和circSV2b探针分别进行RIP和RNA下拉分析。抗AGO2抗体下拉了circSV2b（图4G）。此外，miR-5107-5p存在时作用更为明显（图4G）。circSV2b探针拉下AGO2蛋白（图4H）。上述结果表明，circSV2b作为miRNAs的分子海绵发挥作用。

因为之前的研究已经证实Foxk1是由lncRNA通过ceRNA机制调控的，所以在miR-5017-5p的预测靶基因中，Foxkl被选为下游分子。大多数circSV2b、miR-5107-5p和AGO2共同定位于细胞质中（图4I）。我们还进行了荧光标记实验，以评估miR-5107-5p和Foxk1的结合，发现这两个分子在细胞质中共存（图4J）。我们进一步使用Foxk1探针进行了RNA下拉分析，发现Foxkl和AGO2结合（图4K）。为了证实生物信息学预测分析，对N2A细胞进行了双荧光素酶报告分析。结果表明，转染circSV2b-wt的荧光素酶活性在miR-5107-5p模拟物组中显著降低，在miR-5107-5p抑制剂组中显著升高（图4L，M）。另外，转染Foxk1-wt的荧光素酶活性在miR-5107-5p模拟物组中显著降低，而在miR-5107-5p抑制剂组中升高（图4N）。上述结果表明，circSV2b与miR-5107-5p相互作用，miR-5107-25p与mRNA Foxk1相互作用。

5）Foxk1是Akt1的转录因子

由于氧化应激在PD发病机制中的重要作用，我们使用CUT和Tag-seq筛选与Foxk1下游氧化应激相关的靶基因。我们对对峰值相关基因进行了GO注释和富集分析（图5A和B）。两个样本都富含“氧化应激反应”。在该GO项目中，选择Akt1的峰值检测结果进行可视化；2个样品中的相应峰非常接近Akt1的TTS（图5C）。我们比较了靶峰序列和Foxk1基序，发现它们是一致的（图5D）。

6）circSV2b调节miR-5107-5p的表达，miR-5107-25p影响Foxk1的表达，Foxkl影响Akt1的表达

为了进一步探索ceRNA-Akt1的调节作用，我们使用N2A细胞进行了基因编辑实验。在circSV2b过表达后，miR-5107-5p和Foxk1的表达分别下调和上调（图6A）。WB分析显示，在circSV2b过表达后，Foxk1和Akt1均上调（图6B和C）。我们设计了3个circSV2b干扰质粒。qRT-PCR结果证实shRNA1的干扰作用最为显著（图6D）。qRT-PCR还显示，在circSV2b干扰后，miR-5107-5p和Foxk1表达分别上调和下调（图6E）。WB分析显示，在circSV2b干扰后，Foxk1和Akt1均下调（图6F和G）。miR-5107-5p模拟物转染后，Foxk1和Akt1 mRNA和蛋白表达下调（图7A-C）。miR-5107-5p抑制剂的转染上调了Foxk1和Akt1 mRNA和蛋白表达（图7D-F）。我们设计了一个Foxk1过表达质粒。WB结果表明Foxk1成功过表达，Akt1表达上调（图7G和H）。我们设计了3个Foxk1干扰质粒。WB结果表明，shRNA3的干扰效果最好（图7I和J）。在Foxk1干扰后，Foxkl和Akt1的表达均下调（图7K和L）。

7）circSV2b过表达通过ceRNA-Akt1途径缓解PD中的氧化应激损伤

为了探索circSV2b过表达抵抗PD的机制，我们在AAV注射21天后使用MPTP建立PD小鼠模型。我们评估了ceRNA-Akt1通路中各种分子和氧化应激分子的表达变化。结果表明，circSV2b过表达逆转了MPTP引起的miR-5107-5p的增加，并减轻了Foxk1和Akt mRNA和蛋白表达的减少（图8A和B）。CircSV2b过表达降低了MPTP引起的氧化产物MDA的增加（图8C），也提高了抗氧化酶（SOD和GSH-PX）的活性（图8D）。如图9所示，我们的研究结果表明，在MPTP条件下，circSV2b过表达可防止多巴胺能神经元的神经变性和SNpc的氧化应激损伤。PD中circSV2b过表达的神经保护作用可能主要由miR-5107-5p-Foxk1-cAkt1轴介导。此外，circSV2b可以通过外泌体转运到外周血，其水平变化可以在PD模型的血清外泌体中检测到。总之，我们证明了circSV2b可以作为PD诊断的生物标记物。此外，circSV2-b过表达的良好神经保护作用使其成为PD治疗的一个很有前景的靶点。

结论：

circSV2b过表达通过miR-5107-5p-Foxk1-Akt1信号通路减少氧化应激损伤，保护多巴胺能神经元免受损伤，维持黑质纹状体功能，改善运动障碍。血清外泌体中也可检测到circSV2b的显著变化。因此，circSV2b是PD治疗的理想候选药物，有助于更好地了解PD的发病机制。它还可以作为外周血检测的分子标记物。

参考文献：

Cheng Q, Wang J, Li M, Fang J, Ding H, Meng J, Zhang J, Fang X, Liu H, Ma C, Chen C, Zhang W. CircSV2b participates in oxidative stress regulation through miR-5107-5p-Foxk1-Akt1 axis in Parkinson's disease. Redox Biol. 2022 Aug 12;56:102430. doi: 10.1016/j.redox.2022.102430.