三阴性乳腺癌化疗和免疫治疗期间固有和适应性肿瘤内免疫的单细胞转录组图
乳腺癌（BC）是女性最常见的恶性肿瘤，是全球主要的健康问题。目前，BC的治疗方案主要取决于组织学类型、分子标志物、临床侵袭性和疾病分期。免疫疗法与化疗在三阴性乳腺癌（TNBC）中显示出联合临床活性，这表明一些治疗组合比其他治疗组合更有效。然而，目前尚未对参与这些治疗的主要免疫细胞群进行明确概述。近日，有研究使用单细胞RNA测序技术对两种三阴性乳腺癌小鼠模型的肿瘤微环境（TME）中的免疫景观进行了评估，发表在《Cell Death Discovery》，IF：7.109。
技术路线：
主要研究结果：
1. 两种TNBC小鼠细胞系肿瘤微环境中的全免疫细胞景观
经过质控，4T1的细胞总数和基因总数分别为22,403和18,124，而EMT6的细胞总数和基因总数分别为26,245和18,637。4T1和EMT6细胞TME中共识别出20组和22组具有相似基因表达的细胞（图1）。
20个4T1细胞簇被分类为5个B细胞簇、5个Cd4 T细胞簇、3个Cd8 T细胞簇、1个NK细胞簇、1个T γδ细胞簇、2个DC细胞簇、2个巨噬细胞簇和1个中性粒细胞簇（图1A）。另一方面，EMT6细胞系呈现22个细胞簇，分别为8个巨噬细胞簇、1个单核细胞簇、1个中性粒细胞簇、3个B细胞簇、3个DC细胞簇、4个Cd4 T细胞簇、1个Cd8 T细胞簇和1个NK细胞簇（图1B）。
图1 TNBC小鼠TME的免疫细胞景观
2. 4T1细胞 TME中的Cd4 T细胞样亚簇揭示了小鼠特异性T细胞群的促肿瘤活性
根据标签赋值，将主要包含Cd4、调节性T细胞和γδ T细胞的细胞簇重新聚类。这一过程产生了7个簇（图2A）：两个祖细胞样Cd4 T细胞簇（0和2），以Sell、Ccr7、Lef1和Tcf7基因的高表达为特征（图2B）；Cd8样细胞簇（簇3）显示Cd8a基因的高表达，这些细胞可能是来源于具有混合细胞组成的细胞簇的细胞亚群，因为包含Cd4细胞群而被回收；Treg样细胞簇（簇1）表达高水平的Foxp3和Ikzf2基因；表达Trdc基因的γδ T细胞簇（簇4）；最后，两个具有高表达Nr4a1和Tox基因标记的耗竭样Cd4 T细胞簇（5和6）。伪时间轨迹证实并扩展了对这一子簇组成的理解（图2C）。三个不同的轨迹或集群分化总是从同一个根（簇2）开始。第一种将根（簇2）连接到经过第二祖细胞样簇（簇0）的γδ T细胞簇。第二种轨迹中轨迹的末端是CD8样簇（簇3）。而在第三种轨迹中，簇2生成经过另一种耗尽状态的耗尽样簇5（簇6）（图2C）。在不同条件下，每个簇的细胞百分比差异显著（图2D）。γδ T细胞簇（簇4）在对照组中较高，在所有处理中均低于对照组（图2E）。
图2 4T1中Cd4-like T细胞亚簇分析
CD8 T细胞的亚群确定了7个簇（图3A），这些簇也在本例中与基于一系列基因标记的不同细胞类型相关（图3B）。Sell、Lef1、Tcf7和Ccr7基因的表达证实了两个祖细胞样Cd8簇（0和1）。3个簇（簇3、4和6）具有终末分化特征。簇3高表达细胞增殖相关基因Ccnb2、Cdk1、Mki67和Top2a。簇4是最活跃的簇，因为它具有高水平的Gzmb, Gzmk, Ifng和Ly6c1基因标记。簇6高表达Pdcd1、Lag3、Ctla4、Havcr2，定义为耗竭样CD8簇。最后，簇5与Ncr1基因高水平表达的NKs相关（图3B）。对于耗竭样CD8 T细胞簇（簇6）在涉及环磷酰胺的治疗中减少或未被发现，而在未治疗的TME中它们的百分比较高。同样，在未处理的对照中发现簇4富集，而在C140、C140 + V和C140 + αPD-1处理中，簇4的细胞百分比下降（图3D-F）。此外，轨迹分析显示Cd8 T细胞样亚群的表型异质性与Cd4细胞的表型异质性相同。对于Cd4亚簇，Cd8亚簇的轨迹（图3C）显示了三个不同的谱系，它们共享一个作为根的簇。该细胞簇为祖细胞样细胞簇1。第一个轨迹将根与最耗竭的Cd8簇（簇6）相连。第二个相关的簇1与NKs的簇相连；而第三条轨迹显示了与最活跃的Cd8簇（簇4）通过簇2的联系。这一分析证实了之前的分配和每个基因簇的基因表达特征。
图3 4T1中Cd8-like T细胞亚簇分析
在EMT6 细胞TME中发现的大量巨噬细胞允许这些细胞亚集群。这导致了9个共享相似转录谱的细胞簇的鉴定（图4A）；其中簇2、5和6由于Cx3cr1基因的表达和Ly6c1基因的阴性表达而与M2型巨噬细胞亚型相关（图4B）。观察每个簇在不同条件下的细胞比例，最相关的结果是M2样簇2、5和6（图4C-E），它们表现出相似的趋势：它们的细胞数量在未经治疗的情况下有很高的频率，在所有涉及环磷酰胺的治疗中都有所下降。另一方面，M1样簇1仅在环磷酰胺联合长春瑞滨（C140 + V）处理时表现出显著增加（图4F）。
图4 EMT6中巨噬样细胞亚簇分析
5. 两种细胞系TME中共同的B细胞亚簇比例
由于在两个TNBC细胞系TME中被归类为B细胞的细胞数量相当，作者探究了这些细胞群的亚集群的异同（图5）。4T1细胞系的TME显示出5个集群，而EMT6的TME中观察到8个集群。EMT6模型具有更结构化的子集群，揭示了更多的亚种群。其中，EMT6簇4类似于干扰素诱导的幼稚B细胞（表达Ifit3），而簇1和簇2作为4T1中属于簇1的细胞的一部分，通过Pim1的表达可以清楚地归类为介于增殖和幼稚样B细胞之间的中间状态（图5C, D）。同样，簇4和簇7分别在4T1和EMT6中表达Cd38基因，但Mki67基因不表达（图5C, D）。此外，在两个细胞系中，经处理和未处理的tme之间，共享相同转录谱的细胞比例大致相当。事实上，在未处理的样本中，germinal B细胞（4T1和EMT6中簇4和7）数量很少，而在C140 + αPD-1处理中，两种小鼠模型的germinal B细胞均增加（图5F-H）。此外，proliferative B细胞群的比例也有相似之处 （图5E, G）。对于4T1的簇2和EMT6中簇3，顺铂+ αPD-1条件下germinal B细胞的百分比最高，表明两种肿瘤对这一特定治疗组合的反应具有共同的行为（图5C）。
图5 4T1和EMT6中B-like细胞的亚聚类分析
结论：
作者对免疫TME的精细表征可作为新研究的资源，旨在改善TNBC患者的治疗选择。