VEGF糖基化参与血管生成
N-糖基化和二硫键的形成是蛋白质折叠的两个重要步骤，它们发生在内质网（ER）中，相互影响。本研究为分析N-糖基化和氧化之间的相互作用，研究了蛋白质二硫氧化酶ERO1-α如何影响血管生成VEGF121的糖基化，VEGF121是血管稳态的关键调节因子。本研究揭示ERO1丢失对蛋白质N-糖基化的影响不仅与血管生成有关，而且与其他癌症病理机制有关。本研究于2022年10月发表在《Redox Biology》IF：10.787期刊上。
技术路线：
实验结果：
1、ERO1敲除的细胞氧化能力减弱氧化键形成受损
为了跟踪WT和ERO1 KO HeLa细胞中ER的氧化还原平衡，利用比例氧化还原传感器ER定位的roGFP2。如图1A所示，在WT和ERO1 KO细胞中，DTT刺激后ER roGFP2迅速减少；然而，在还原剂的洗脱过程中，ERO1 KO细胞表现出较慢的恢复速度，而WT细胞的氧化平衡恢复得很快，ERO1 KO细胞在40分钟内未达到WT细胞的氧化平衡基线值，这表明缺乏ERO1会损害ER的氧化平衡。
为评估ERO1缺失对ER中二硫键形成速率的影响，作者构建了FLAG-VEGF121，它被组装成二硫连接的同型二聚体（图1B），并比较了在WT和ERO1 KO细胞中，在蛋白合成抑制剂CHX脉冲作用后，细胞内形成二硫连接的同型二聚体的速率。结果显示，FLAG-VEGF121在WT和ERO1 KO细胞中的积累程度相似；然而，虽然在WT细胞中二聚体是所有时间点的主要物质，但在ERO1 KO细胞中，二聚体的生成速度较慢，单体在冲洗过程中积累，表明单体转化为二聚体的速度较慢（图 1C）。 因此，由ERO1损失引起的氧化平衡的改变转化为 VEGF121 二硫键形成速率的损害。
图1ERO1 KO细胞中氧化能力受损和VEGF121二硫键形成延迟
2、ERO1 KO细胞分泌的VEGF121无链内二硫键的缺陷而是N75上高糖基化
为分析WT和ERO1 KO HeLa细胞分泌的FLAG-VEGF121，收集两细胞系的条件培养基，用N -乙基马来酰亚胺（NEM）烷基化，然后用FLAG-M1抗体免疫沉淀。免疫沉淀采用非还原SDS-PAGE分析。经考马斯蓝染色发现WT细胞的FLAG-VEGF121有三个主要条带，对应于VEGF121的二聚体和寡聚体，而ERO1 KO细胞的FLAG-VEGF121只有两个条带，即一个微弱的寡聚体和一个比WT细胞分泌的慢的迁移二聚体（图2A）。从凝胶中分离这些条带，DTT还原并用碘乙酰胺（IAA）烷基化，这一处理导致二硫键中半胱氨酸被标记，导致氨基甲基(CAM)富集，最后进行nLC-ESI-MS/MS（图2B）。裂解肽的质谱显示，WT和ERO1 KO分泌的FLAG-VEGF121在NEM和IAA肽烷基化方面没有太大差异。例如，参与VEGF121链内二硫键的C68只以氧化形式存在于WT和ERO1 KO细胞的VEGF121中；C102也参与VEGF121的链内二硫键，在WT和ERO1 KO细胞的VEGF121中均以混合还原和氧化状态检测到，这表明在ERO1 KO细胞中FLAG-VEGF121的分子内二硫键没有缺陷（图2B）。
使用NetNGlyc在线软件预测VEGF121 氨基酸序列的共有序列 NIT 内75号位处存在N-糖基化位点。因此，作者假设图2A迁移较慢的条带是N-糖基化的产物，并使用糖苷内切酶对此进行测试。如图2C所示，WT和ERO1 KO细胞的FLAG-VEGF121对内糖苷酶H （ENDO H）不敏感，但对肽- N -糖苷酶F （PNGase F）敏感，导致快速迁移的蛋白质消失。这些结果表明，迁移较慢的多肽含有N -链寡糖，在高尔基体中已经成熟，从而获得了对EndoH的抗性。用PNGase F（一种酰胺酶）处理后，糖基化Asn残基被脱酰胺。对WT和ERO1 KO细胞中FLAG-VEGF121二聚体和寡聚体的片段肽进行质谱分析，然后用PNGase F酶切，证实天冬酰胺N75被糖基化，除了来自WT细胞的低聚物2（图2D）。挽救实验证实了ERO1在限制糖基化中的作用。在 ERO1 KO 细胞中转染ERO1或其高活性突变体ERO1C131A的表达质粒，通过改变糖基化形式占总量的 80% 至 40%，拯救了ERO1 KO细胞分泌的FLAG-VEGF121的N-高糖基化（图2E）。
图2 ERO1 KO细胞分泌的VEGF121链内二硫键和N-高糖基化
3、ERO1 KO细胞VEGF121的N75高糖基化导致分泌动力学缺陷
接下来比较VEGF121在WT和ERO1 KO细胞的分泌动力学，并研究N-高糖基化如何影响这一过程。结果发现ERO1 KO细胞分泌VEGF121的动力学受损，在最后两个时间点达到平台期（图3A）。为研究该损伤是否由于高糖基化，构建一个突变体，其中N75被Gln残基（N75Q）取代。发现VEGF121突变体在WT和ERO1 KO细胞中表达时都没有糖基化（图3B）。值得注意的是，该突变体在WT和ERO1 KO细胞中的分泌动力学相当，而在ERO1 KO细胞中的分泌受影响较小（图3C-3D），表明N75的高糖基化是ERO1 KO细胞中FLAG-VEGF121分泌受损的基础。
图3 ERO1 KO细胞分泌的VEGF121的N75高糖基化损害其其分泌动力学
4、VEGF121在ERO1 KO细胞中仍具有受体能力但在缺氧条件下受体能力丧失
突变为FLAG-VEGF121的C60 (C60S)或C68 (C68S)丝氨酸，分别参与链间和链内二硫键（图1B），增加了WT细胞分泌的VEGF121的N-糖基化，表明VEGF中二硫键形成的受损改善了其N -糖基化（图4A）。与未突变的VEGF121相比，WT细胞中C60的分泌不受影响，而C68的分泌受损60%（图4A）。当ERO1 KO细胞分泌两种突变体C60和C68时，未观察到高糖基化，表明ERO1缺失是VEGF121糖基化的主要影响。与相同细胞中未突变的VEGF121相比，ERO1 KO细胞中C60的分泌不受影响，而C68的分泌受损85%，WT细胞中C68的分泌受损更严重（图4A）。
利用表面等离子体共振（SPR）来确定Aflibercept的不同形式VEGF121的相对解离常数（KD），这是一种亲和力的测量方法，Aflibercept是人IgG1的Fc区与VEGF两受体VEGFR1和R2之间的融合蛋白。结果表明，ERO1 KO细胞分泌的VEGF121对受体的亲和力大约是WT细胞分泌的VEGF121的2倍（但无统计学差异），但突变的VEGF121 C60S的亲和力是WT细胞分泌的VEGF121 C68S的6倍，而突变的VEGF121 C68S则完全不与受体结合。表明，来自ERO1 KO细胞的VEGF121仍然具有受体活性，排除了其大规模氧化展开的可能（图4B）。
在低氧条件下，WT细胞分泌的VEGF121在糖基化或分泌量方面与正常缺氧条件下分泌的VEGF121相比，差异可以忽略不计（图4C）。此外，其KD在数量上与常氧条件下分泌的对应物相似（图4D）。相反，在缺氧条件下，ERO1 KO细胞中VEGF121的分泌量受到严重影响（图4C），这表明在ERO1缺失的条件下，VEGF121的成熟和分泌特别依赖氧气。此外，KD降低两倍表明缺氧条件下ERO1 KO细胞VEGF121受体能力进一步受损（图4D）。
图4 ERO1 KO细胞的VEGF121具有受体能力但在缺氧条件下其受体能力受损
5、VEGF121和STT3B之间加强的联系导致ERO1 KO细胞的高糖基化
正如已经观察到的，在ERO1 KO细胞中，细胞内VEGF121以及分泌形式都是高糖基化的。然而，与分泌型VEGF121不同的是，N-糖基化的细胞内形式对EndoH和PNGaseF都敏感（图5A）。在WT和ERO1 KO细胞中，VEGF121对两种内糖苷酶的敏感性没有差异，这表明在稳定状态下，两种细胞系中大多数细胞内VEGF121都没有通过高尔基体过渡。细胞内FLAG-VEGF121 C68S和C68S的表现与WT细胞中高糖基化的分泌对应物非常相似，与ERO1 KO中的原生形式没有相关差异（图5B）。为从分子层面深入了解VEGF121高糖基化的原因和/或后果，分析了VEGF121在WT和ERO1 KO细胞中的相互作用物。转染VEGF121、VEGF121C60S和VEGF121C68S的WT和ERO1 KO细胞的蛋白裂解物用FLAG M1抗体免疫沉淀后SDS-PAGE电泳。在考马斯蓝凝胶中，可以看到贯穿泳道的一系列条带（图5C）。
图5 在ERO1 KO和半胱氨酸突变体中细胞内VEGF121高糖基化
对图5C的每个泳道进行单独的切除和消化，将洗脱后的多肽进行nLC-ESI MS/MS分析，从而鉴定出VEGF121相互作用分子。对ERO1 KO细胞中VEGF121、VEGF121C60S和VEGF121C68S相互作用分子的通路分析表明，主要富集至通过天冬酰胺进行N-链糖基化的通路（图6A）。研究发现，在ERO1 KO细胞中，含有硫氧还蛋白结构域的STT3B复合物亚基MAGT1与所有三个VEGF121相互作用（图6B）。基于此，作者决定关注VEGF121C68S，因为C68中的突变是最接近糖基化Asn的，因此，其糖基化应该受MAGT1影响较小。免疫沉淀证实，VEGF121和VEGF121C68S在WT和ERO1 KO细胞中均存在MAGT1免疫反应带（图6C）。用MAGT1-HA转染的WT和ERO1 KO细胞的NEM烷基化允许在非还原免疫印迹上解析 MAGT1 的不同氧化还原形式。来自ERO1 KO细胞的MAGT1出现在大约52 kDa的缓慢迁移带中，这在 WT 细胞中不可见，表明 MAGT1 在 ERO1 KO 细胞中的氧化还原介导的相互作用（图6D）。在WT和ERO1 KO细胞中，MAGT1和STT3B的缺失导致VEGF121和VEGF121C68S的低糖基化，表明VEGF121及其突变体都是STT3B/MAGT1的底物（图6E）。然而，VEGF121C68S（最接近天冬酰胺的半胱氨酸突变体）的N-糖基化对 STT3B/MAGT1干扰不敏感。这些发现表明，ERO1缺失通过MAGT1增强了STT3B与VEGF121底物之间的相互作用，导致其N-高糖基化。
图6 ERO1-KO细胞中VEGF121及其半胱氨酸突变体与MAGT1的相互作用增强
6、缺乏ERO1的乳腺肿瘤异种移植瘤显示糖基化改变
为探究ERO1在肿瘤中的生理性影响，构建ERO1缺失或未缺失的三阴性乳腺肿瘤模型。用两种具有不同糖特异性的凝集素：小麦胚芽凝集素（WGA）和隔离素B4（IB4）对异种移植物切片进行染色。结果如图7所示，虽然IB4染色在两种基因分化肿瘤中表现相似，但ERO1 KO细胞中的WGA染色平均比WT细胞高1.5倍，并在KO细胞中表现出斑片状聚集模式。对这些肿瘤簇所占体积的定量分析显示KO肿瘤与WT肿瘤相比增加了5倍，表明ERO1缺陷在调节糖基化方面具有广泛的作用。
图7 ERO1-KO乳腺肿瘤表现为N-高-糖基化蛋白模式
综上所述，本研究证实ERO1缺失会导致较少的氧化ER氧化还原平衡。这导致 VEGF121中二硫键形成延迟，这有利于其N-高糖基化并增加MAGT1捕获潜力，进一步增加其在N75上的糖基化。这反过来减慢了ERO1耗尽细胞中生长因子的分泌，如图8所示。
图5 机制模式图
参考文献：
Varone Ersilia., Chernorudskiy Alexander., Cherubini Alessandro., Cattaneo Angela., Bachi Angela., Fumagalli Stefano., Erol Gizem., Gobbi Marco., Lenardo Michael J., Borgese Nica., Zito Ester.(2022). ERO1 alpha deficiency impairs angiogenesis by increasing N-glycosylation of a proangiogenic VEGFA. Redox Biol, 56(undefined), 102455. doi:10.1016/j.redox.2022.102455