LnRNA提供了重要的染色质支架——为蛋白质相互作用和骨髓瘤生长

多发性骨髓瘤是一种复杂的浆细胞恶性肿瘤，约占血液系统肿瘤的10%，目前仍无法治愈。越来越多的证据表明非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）在多发性骨髓瘤中发挥关键作用。在本研究中，作者使用了大规模的CRISPR干扰活性筛选来询问多发性骨髓瘤中细胞生长对lncRNA基因的依赖性，并确定了miR-17-92集群宿主基因（MIR17HG）的突出作用，发现一种MIR17HG衍生的lnc-17-92，以一种独立于microRNA和DROSHA的方式为c-MYC与WDR82之间的相互作用提供了染色质支架，从而促进ACACA的表达。本研究建立了一种新的致癌基因MIR17HG，为转化临床试验提供了有效的抑制剂。

技术路线：

主要研究结果：

1、CRISPRi活性筛选确定MIR17HG为MM中主要的细胞生长依赖

作者分析了360个新诊断的多发性骨髓瘤（MM）患者的RNA-seq数据，并在原代MM细胞和70个MM细胞系中鉴定了913个lncRNA转录本( 图1A，I )。为系统地研究这些lncRNA在MM细胞生长中的作用，作者转导了3个MM细胞系( H929、KMS-11和KMS-12-BM )，该细胞系表达了dCAS9 - KRAB融合蛋白，该文库由7个sgRNA（small guide RNA）组成，分别针对所识别的lncRNA的913个转录起始位点( TSS )和576个阴性对照sgRNA ( 图1A、II )。3周后，作者使用深度测序和基于模型的全基因组CRISPR - Cas9基因敲除( MAGeCK )稳健排序聚合算法( RRA )对MM细胞群体中相对贫乏或富集的sgRNA进行了测试。

最富集或最贫乏的sgRNA在次级筛选中进一步测试，使用224个靶向lncRNA的TSS混合文库，已知蛋白编码癌基因( MYC、IRF4 )或肿瘤抑制因子( TP53 )的TSS作为阳性对照，2245个非靶向sgRNA作为阴性对照( 图1A，III )。在次级筛选中，4个MM细胞系( H929、KMS11、KMS12BM和AMO1)被用来检测和排序显著耗尽或富集的sgRNA。如预期的那样，靶向IRF4和MYC的sgRNA在3种( MYC )或全部( IRF4 )细胞系中显著缺失，而靶向TP53的sgRNA在两种TP53野生型细胞系( AMO1和H929 )中显著富集。

作者对sgRNA敲除进行排序分析，发现MIR17HG是最主要的依赖，在所有测试的细胞系中，RRA评分等于或优于靶向MYC或IRF4的评分（图1B）。为进一步验证这一数据，作者接下来在四环素诱导系统启动子的调控下，转导4个靶向MIR17HG的sgRNAs转导表达dCAS9 - KRAB融合蛋白的MM细胞系，观察到感染非靶向sgRNAs的细胞相比，持续暴露于强力霉素后，细胞生长减少（图1C）。此外，作者使用2种不同的锁核酸( LNA ) gapmeR ASOs（反义寡核苷酸）靶向MIR17HG新生RNA ( pre-RNA )，用于RNase H介导的降解，转染11种MM细胞系，包括对常规抗MM药物（AMO1-ABZB对硼替佐米耐药；AMO1-ACFZ对卡非佐米耐药；MM.1 R对地塞米松耐药）耐药的细胞系，并证实对MM细胞活力的显著影响独立于遗传和分子背景（图1D）。

图1 CRISPRi活性筛选确定MIR17HG为MM中主要的细胞生长依赖

2、MIR17HG衍生的lnc-17-92以不依赖于miRNA和DROSHA的方式介导细胞生长依赖性

MIR17HG是miRNA簇miR-17-92和lncRNA的一个位点，命名为lnc-17-92。lnc-17-92有两种异构体，一种是~ 5000 nt长的(lnc-17-92TV1)，另一种是~ 900 nt的( lnc-17-92TV2)，它们都尚未被功能研究( 图2A )。在MM细胞系中，作者通过单分子RNA-FISH证明了lnc-17-92的核富集( 图2B )。作者发现在3个大队列的初诊MM患者中，lnc-17-92的高表达与更短的无事件生存( EFS )和总生存( OS )相关( 图2C )。

为检测lnc-17-92的独立活性，作者首先通过异位表达原始前体pri-mir-17-92建立过表达miR-17-92的两种MM细胞系。在这些细胞系中特异性敲除lnc-17-92，ASOs靶向MIR17HG前体RNA的5’ 端，该区域不被pri-mir-17-92覆盖，并观察到细胞生长的显著抑制，而异位的pri-mir-17-92不能挽救细胞生长( 图2D )。接下来，作者建立了两个DROSHA基因敲除( DR-KO )的MM细胞系( AMO1DR-KO和H929DR-KO)，使用ASO1处理敲低lnc-17-92后，在DR-WT和DR-KO细胞系统中仍然观察到强烈的抗增殖活性( 图2E )。重要的是，在NOD SCID小鼠中，暴露于gymnotic ASO1会破坏AMO1DR-KO细胞建立肿瘤的能力，导致动物生存期延长(图2E - G)。这些结果表明，lnc-17-92TV1是MIR17HG癌症依赖性的主要中介因子，独立于miR-17-92的作用和生物发生途径。

图2 MIR17HG衍生的lnc-17-92以不依赖于miRNA和DROSHA的方式介导细胞生长依赖性

3、Lnc-17-92与ACACA形成转录轴，促进MM细胞生长

Lnc-17-92的核富集提示其可能在基因表达调控中发挥作用。因此，作者在DR-WT ( AMO1和H929 )和DR-KO ( AMO1DR-KO ) MM细胞系中使用早期暴露于gymnotic ASO1来消除lnc-17-92，以避免在DROSHA WT细胞中调节miR-17-92和miR-17-92的经典靶标，并在所有测试的细胞系中鉴定出7个lnc-17-92消除后迅速下调的基因( 图3A )。作者在体外用ASO1处理3例MM患者的CD138 +细胞验证了这些发现( 图3B )。此外，作者在2个大型RNA-seq MM患者数据集( IFM / DFCI和MMRF / CoMMpass)中观察到lnc-17-92与其靶基因之间存在显著的正相关性( Spearman r > 0.3 ; p < 0.001) ( 图3C )。

利用荧光素酶报告基因实验，在293TDR - KO细胞中，在存在或不存在lnc-17-92缺失的情况下，作者证明了lnc-17-92对这些基因的调控，除了ANO6，发生在启动子水平( 图3D )。与此一致，作者通过染色质分离RNA沉淀( ChIRP )实验和qRT - PCR分析证实了lnc-17-92在顶端靶标ACACA的启动子区域存在相互作用( 图3E )，并且通过对lnc-17-92和ACACA前体mRNA的单分子双RNA FISH分析显示lnc-17-92频繁地定位到ACACA位点( 图3F )。与随机斑点相比，lnc-17-92在ACACA基因位点的近端定位明显更频繁( 图3F )。

在已确定的lnc-17-92靶点中，ACACA对MM细胞的增殖和存活影响最大( 图3G )。ACACA编码脂肪从头合成途径的限速酶ACC1，在不同的癌症环境中支持肿瘤发生。这些数据表明lnc-17-92是一种染色质相互作用的lncRNA，具有转录调节功能。

图3 Lnc-17-92与ACACA形成转录轴，促进MM细胞生长

4、Lnc-17-92直接与c-MYC相互作用，促进其在ACACA启动子上的占用。

作者进行RNA Protein pull-down ( RPPD )实验，发现MYC与lnc-17-92TV1形成复合物( 图4A )。用MYC抗体进行RNA免疫沉淀实验( RIP )证实lnc-17-92TV1的富集( 图4B )。此外，RNA yeast-3-杂交( Y3H )实验证实了在体内细胞模型中lnc-17-92TV1-MYC相互作用，如酵母克隆生长所示( 图4C )。

接下来，作者评估MYC和lnc-17-92是否协同促进ACACA在MM细胞中的表达。在MM细胞中敲除lnc-17-92的确可以在不影响MYC表达的情况下消除MYC在ACACA启动子上的占位( 图4D )，并且仅在高MYC水平存在的条件MYC Tet - Off细胞系P493 - 6中降低ACACA的表达( 图4E )。这些数据表明lnc-17-92TV1与转录因子MYC形成RNA -protein复合体，促进其在ACACA启动子上的染色质占用和转录活性。

图4 lnc-17-92直接与c-MYC相互作用，促进其在ACACA启动子上的占用

5、Lnc-17-92介导MYC-WDR82转录复合体的组装，导致ACACA的转录和表观遗传激活

为确定lnc-17-92是否影响这些蛋白质-蛋白质相互作用，作者在三个MM细胞系( AMO1、H929和U266MYC +)中整合了邻近依赖性生物素识别( BioID )分析、免疫共沉淀实验和质谱分析( Co-IP/MS )的结果。这一分析突出了WDR82是一个非常高可信度的lnc-17-92依赖的MYC互作因子( 图5A )。RPPD和RNA Y3H实验进一步证实lnc - 17 - 92TV1和WDR82之间存在直接的RNA -protein相互作用( 图5B-C )。

WDR82是SET1甲基转移酶复合物的调节成分，它在活性位点的转录起始位点催化组蛋白H3 Lys-4 ( H3K4 )甲基化( mono-，di-，tri-)，这是MYC与染色质结合和反式激活的先决条件。在MM细胞中，敲低WDR82降低了ACACA启动子上H3K4me3和MYC的占位（图5D-E），降低了ACACA mRNA表达（图5F）。这证实在MM细胞中沉默WDR82对H3K4甲基化的整体影响。此外，研究利用表达异位WDR82 - GFP融合蛋白的MM细胞证明了lnc-17-92表达对于WDR82在ACACA启动子上的占位是必需的（图5G）。此外，lnc-17-92缺失导致ACACA启动子上H3K4me3水平降低（图5H），但不影响H3K4甲基化状态( 图5I )。

这些发现表明lnc-17-92TV1是一个染色质支架，介导MYC-WDR82多蛋白转录复合体的组装，以控制ACACA和可能的其他基因的表达。

图5 Lnc-17-92介导MYC-WDR82转录复合体的组装，导致ACACA的转录和表观遗传激活

6、MIR17HG的治疗抑制剂在人MM动物模型体内外均具有抗肿瘤活性

为开发临床应用的抑制剂，作者筛选了八十多个fully phosphorothioated ( PS )、2 ' – O-methoxyethyl（2 '-MOE）修饰、lipid-conjugated的ASOs，它们既可以触发RNase H介导的MIR17HG pre-RNA ( gapmeRs ) 降解，也可以通过RNase H-independent机制( blockmeRs )发挥作用。该方法鉴定了一种18-mer tocopherol (T)-conjugated gapmeR G2-15b-T ( ' G ' )和一种18 – mer tocopherol (T)-conjugated steric blockers SB9-19-T ( ' B ' )，它们在大量MM细胞系和CD138 +原代MM细胞中都具有强烈的抗增殖作用，同时保留了来自3个健康捐献者的非恶性细胞系（THLE-2、HK-2、HS-5和293T）和PBMC（外周血单核细胞）。

为评估这两个化合物的体内抗肿瘤活性，作者首先使用免疫缺陷的NOD SCID小鼠建立了基于AMO1的浆细胞瘤异种移植模型。在这里，作者观察到G2-15b-T（肿瘤生长抑制，TGI=76%）或B9-19-T（TGI=69%）治疗周期后肿瘤生长显著减少（图6A）。对该治疗后小鼠的肿瘤进行分析，证实了lnc-17-92的表达降低（图6B），以及lnc-17-92的靶标( ACACA、EPT1、EXT1、CCDC91、ANO6、FER和ZYG11A)的调节（图6C）。

接下来在弥漫性骨髓瘤侵袭模型中证实了G2-15b-T和B9-19-T具有显著的抗MM活性，其中MOLP8-luc + MM细胞的肿瘤生长通过生物发光成像( BLI )评估。在该模型中，用G2-15b-T ( TGI = 84 % )或B9-19-T ( TGI = 52 % )治疗一个周期后，肿瘤生长明显被拮抗。用G2-15b-T治疗后，8只小鼠中有2只( 25 % )肿瘤被清除（图6D）。重要的是，两种抑制剂都显著延长了动物的存活时间（图6E）。

最后，作者通过尾静脉注射从晚期患者( PDX-NSG )获得的CD138 + MM细胞，建立了临床相关的PDX-NSG小鼠模型。在这个模型中，使用人类kappa light chain作为替代物在血清样本中监测肿瘤生长。值得注意的是，作者观察到G2-15b-T治疗周期后肿瘤生长的消退，其效果与硼替佐米（阳性对照）相当（图6F）。

图6 MIR17HG的治疗抑制剂在人MM动物模型体内外均具有抗肿瘤活性

结论

总的来说，这项研究建立了具有独特的lncRNA功能的MIR17HG，它能促进蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用，对促进肿瘤治疗有积极意义。

参考文献

Morelli E, Fulciniti M, Samur MK, Ribeiro C, Wert-Lamas L, Henninger JE, et al. A MIR17HG-derived Long Noncoding RNA Provides an Essential Chromatin Scaffold for Protein Interaction and Myeloma Growth. Blood. 2022 Sep 20:blood.2022016892. doi: 10.1182/blood.2022016892.